论文部分内容阅读
研究背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最具侵袭性的癌症之一,由于缺乏有效的治疗方法,其总体生存率很低。肿瘤微环境（Tumor micro-environment,TME）积极参与肝纤维化、HCC 发生、侵袭和转移的调节。中医肿瘤病机是TME异质的高度概括,中医药抗HCC的显著特点在于通过多靶点效应对TME进行调节和改善。自噬在HCC发生和进展中发挥双重作用,自噬的三种主要类型都终止于溶酶体,被称为自噬溶酶体途径（Autophagy-lysosomal pathway,ALPs）。自噬可能是中医“扶正祛邪”治则的微观化机制。青蒿琥酯（Artesunate,ART）是一个多靶点、多途径起效的药物,已被证实具有高效低毒的抗HCC活性和自噬调节能力,但ART能否通过靶向ALPs干预HCC恶性进展尚不清楚。因此,本研究首先利用临床队列的HCC和非癌性肝组织配对样本,筛选HCC发生相关的候选关键基因并评价其临床意义;其次开展分子层面、细胞层面和动物层面等多维度实验,从ART改善TME优势环节出发,考察其干预肝纤维化-HCC恶性转化轴的药效,并从ALPs角度探索其作用机制,期望能为肝纤维化-HCC恶性转化分子事件的解读提供新的机制、为HCC临床提供新的治疗靶点和方法,同时丰富中医药“扶正祛邪”干预TME的微观机制内涵。研究方法与结果1.肝纤维化-HCC恶性进展相关候选关键基因筛选和临床相关性评价本研究经中国中医科学院中药研究所研究伦理委员会和中国人民解放军总医院第五医学中心（2016003D）批准,所有研究对象知情且同意。1.1.利用临床队列样本开展芯片/微阵列检测和实时荧光定量PCR检测,筛选HCC候选关键基因利用本项目组收集到的临床队列（包含99例HCC和18例非癌性肝组织样本,来自中国人民解放军总医院第五医疗中心的100例HCC患者）,对其中3对原发性HCC组织和非癌性肝组织进行芯片/微阵列检测实验,结果发现,与非癌性肝组织相比,HCC组织中共发现了 1766个差异基因,包括1248个上调表达基因,518个下调表达基因。通过功能富集分析结果表明,上述HCC差异基因显著参与了细胞自噬相关的通路。其中,编码溶酶体水解酶-葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GCase）的基因GBA在HCC及非癌肝脏组织中的差异表达特征如下:临床芯片结果显示,GBA为显著过表达基因之一（癌与非癌,7.54±1.10 与 5.73±1.02,P=0.03）。临床 qPCR 实验表明,GBA 基因在 HCC 组织中显著高表达（癌与非癌,0.07±0.07与0.01±0.01,P＜0.001）。上述结果表明葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GCase,由GBA基因编码）可能是在肝纤维化-HCC恶性病理进展过程中发挥关键功能的候选关键基因之一。1.2.利用本项目组收集到的和源于TCGA数据库的临床信息,考察GBA与HCC临床病理特征和患者预后的相关性为评价GBA在人类HCC中的临床意义,以GBA基因在本项目组所收集到的所有99例HCC组织中的表达量中位数（0.506）作为卡值,将患者分为GBA高表达组和低表达组（分别为n=50和49例）,结果表明GBA高表达组较GBA低表达组更多地出现较高的血清AFP水平（0.01＜P＜0.05）和肿瘤分级（P＜0.01）。对TCGA数据集的统计分析结果显示,GBA的显著过表达与老年患者的年龄（P=0.02）、转移（0.01＜P＜0.05）和血管侵犯（P=0.04）以及HCC患者的不良总体生存期（P=0.01）显著相关。来自本项目组的临床队列和TCGA数据集的Kaplan-Meier生存分析结果均显示,GBA高表达组的总体生存率（分别P=0.0274和P=0.0151）和无病组（分别P=0.0377和P=0.0405）生存率均比低表达组更差。2.GBA异常表达对HCC恶性特征的影响2.1.开展细胞功能实验,正向和反向考察GBA对两种HCC细胞的促癌功能针对两种人源HCC细胞系HepG2细胞和MHCC-97H细胞,以WRL68人正常肝细胞为对照,开展蛋白质印迹（Western Blot）实验,检测上述细胞中的本底GBA蛋白质表达量。利用慢病毒过表达GBA载体,通过细胞转染,构建GBA过表达细胞株,并开展Western Blot实验,验证目的基因的过表达效果。采用GBA特异性小干扰RNA（siRNA）,构建瞬时转染载体（si-GBA-313、si-GBA-1255和si-GBA-1620）,通过细胞转染,构建GBA敲低表达细胞株,进一步的Western Blot实验结果显示,上述特异性siRNA转染能显著抑制HepG2和MHCC-97H细胞中的GBA蛋白质表达量。但考虑到GBA基因通过调控GCase水解酶的表达和活性干预溶酶体和细胞自噬功能,故后期拟采用GBA酶活性激动剂LTI-291作为GBA功能增强实验的对照。细胞功能实验结果表明,与对照组相比,敲低GBA表达量后,HepG2和MHCC-97H细胞的增殖能力、克隆能力均显著降低（P＜0.05,P＜0.01）,敲低GBA通过增加早期和晚期凋亡细胞的百分比（P＜0.01）有效诱导细胞凋亡,同时表现出细胞周期的G1期阻滞（P＜0.05）。相应地,GBA激活因子LTI-291处理显著逆转了 GBA下调对两种HCC细胞增殖、细胞周期和细胞集落的抑制作用及其对细胞凋亡的诱导作用（所有P＜0.05）。2.2.开展免疫组化与免疫荧光实验,研究GBA和自噬标志物在临床HCC样本中的表达情况利用来自同一患者的HCC样本开展免疫组化与免疫荧光分析,检测GBA蛋白质表达量和自噬通量[微管相关蛋白1轻链-3B（microtubule-associated protein 1 light chain-3B,LC3B）、Sequestosome 1（SQSTM1/p62）]蛋白的表达水平,结果表明,HCC组织均呈现GBA蛋白和SQSTM1/p62积累的强阳性染色,以及LC3B荧光斑点数量的增加（P＜0.001）。2.3.开展Western Blot实验和透射电镜检测,研究GBA对HCC细胞自噬通量的影响Western Blot结果显示,在HepG2细胞中GBA敲低联合巴非霉素A1（Bafilomycin A1,BAF,一种自噬晚期抑制剂）处理组与GBA敲低组相比,LC3B和SQSTM1/p62蛋白的表达水平显著上调（P＜0.05）。透射电镜显示了不同处理组HepG2细胞的超微结构,在GBA敲低细胞中发现了大量的自噬小体,GBA敲低和BAF联合处理增加了自噬小体的数量（P＜0.01）。而用GBA激活剂LTI-291处理组可使自噬小体的数量降低（P＜0.01）,说明GBA的敲低可能导致HCC细胞的自噬降解受损,而GBA的激活部分逆转了这一结果。3.GBA是ART直接作用靶点的辨识和验证利用本项目合作课题组前期已成功构建的具有青蒿素活性的生物探针,以HepG2细胞为载体,人源正常肝细胞株WRL68为对照,采用亲和性蛋白质组学方法鉴定ART抗HCC候选靶标谱。探针标记的液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）实验、拉下（Pull down/WB）实验和表面等离子体共振（surface plasmon resonance technology,SPR）实验,发现和验证 ART 和 GBA 的直接靶向关系,测得两者的结合活性为KD=40μM。4.在细胞层面进行ART通过靶向调控GBA所介导的ALPs从而发挥抗HCC作用的机制研究4.1.GBA参与了 ART对HCC细胞的抑制作用细胞功能实验结果表明,ART以剂量依赖性的方式抑制了两种HCC细胞的增殖、克隆形成,细胞周期G1期阻滞,诱导了 HCC细胞凋亡（P＜0.05）。而LTI-291联合处理则逆转了 ART对HCC细胞增殖、细胞周期和细胞克隆的抑制作用以及其对细胞凋亡的诱导作用（P＜0.05）。4.2.ART通过靶向GBA抑制HCC细胞的自噬降解Western Blot实验结果表明,不同剂量ART处理均有效降低了 HepG2细胞中GBA蛋白质的表达量,同时促进了 LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化,提高了SQSTM1/p62的表达（P＜0.05）。透射电镜检测发现ART处理显著增加了HepG2细胞中自噬小体的数量,联合GBA敲低组增强了这种趋势,而联合LTI-291组逆转了这种增加（P＜0.05）。5.在动物模层面验证ART通过靶向调控GBA所介导的ALPs而发挥其抗HCC作用的分子机制雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（n=80,体重240-260g）购自广东省医学实验动物中心（许可证号SCXK2013-0002）。雄性BALB/c裸鼠（n=64,体重:15±2g;年龄:7-8周）购自广东省医学实验动物中心（许可证号:SCXK-2018-0186）。本研究动物实验经广东省动物伦理委员会批准（批准号IACUC-AEWC-F2005003）。5.1.ART抑制GBA的过表达,减轻炎症诱导型HCC的发生DEN诱导的HCC大鼠模型实验大体解剖学观察结果和病理组织切片[苏木精-伊红染色（Hematoxylin Eosin staining,HE染色）]结果表明,ART通过降低肝脏炎症反应和恶变程度,有效地逆转了肝脏炎症向癌症的病理变化。DEN组和DEN+ART组大鼠的体重值和肝脏指数均显著低于CON组和ART组（P＜0.05）。CON组和ART组、DEN组和DEN+ART组之间的体重和肝脏指数均无显著性差异。ART有效降低了 DEN诱导而异常升高的血清生化指标[谷丙转氨酶（Alanineaminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase,AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、透明质酸（Hyaluronic acid,HA）和甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）]水平（P＜0.05）。免疫组化和免疫荧光检测结果说明,ART抗HCC药效与GBA诱导的自噬降解有关。DEN诱导的GBA和SQSTM1/p62蛋白胞质阳性染色较强,经ART干预后,GBA蛋白的表达水平显著降低,而SQSTM1/p62蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）。免疫荧光检测显示,DEN给药后存在的LC3B荧光斑点,在ART干预后增加（P＜0.05）。5.2.ART阻滞GBA介导的自噬降解,减轻荷瘤原位癌裸鼠的肿瘤负担荷瘤原位癌裸鼠实验大体解剖学观察结果说明,与模型组相比,ART治疗有效地减小了肿瘤的体积。透射电镜检测显示,ART显著增多了肿瘤组织中自噬小体的积累,与ART和LTI-291单独处理组相比,ART和LTI-291联合处理时的自噬小体数量分别减少和增加（P＜0.05）。免疫荧光分析揭示了 GBA与LC3B和SQSTM1/p62蛋白在不同组肿瘤组织中的共定位。ART给药组的LC3B和SQSTM1/p62蛋白水平升高,GBA水平降低,而LTI-291逆转了这种趋势。结论1.GBA在HCC组织中显著过表达,并与HCC恶性进展和不良预后显著相关。2.GBA具有促癌功能,抑制GBA异常高表达能有效降低HCC细胞的恶性行为。3.在临床HCC样本、DEN诱导型肝癌大鼠和荷瘤原位癌裸鼠的肝脏肿瘤组织及体外HCC细胞中,GBA高表达与HCC细胞过度激活的自噬活性密切相关。4.GBA是ART的直接作用靶点之一,ART可有效抑制GBA表达量,导致自噬晚期阻滞（ALPs受损）,且这种作用可被GBA激动剂LTI-291部分逆转。5.ART通过靶向调控GBA介导的ALPs而发挥其抗HCC作用。