论文部分内容阅读
目的:酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是肝脏疾病导致人体死亡的主要原因,包括肝脂肪变性、酒精性肝炎、纤维化、肝硬化等一系列病变过程,在某些情况下最终可发展为肝细胞癌。大多数长期酗酒者由于持续性的酒精摄入会发展为酒精性脂肪肝。高达三分之一的持续酗酒者会进展为酒精脂肪性肝炎（Alcoholic steatohepatitis,ASH）,其中高达20%的人将发展为酒精性肝硬化（Alcoholic cirrhosis,AC）。约2%的肝硬化患者会发展为原发性肝癌。在重度酒精脂肪性肝炎患者中,可能会发生以黄疸和肝功能衰竭为特征的急性酒精性肝炎（Alcoholic hepatitis,AH）。存活的急性肝炎患者约有70%病情将发展为肝硬化。此外,肝硬化患者可能继发急性酒精性肝炎,死亡率较高。故而酒精暴露是酒精性肝病发生发展的重要因素,对酒精暴露情况下肝细胞的代谢特别是酒精代谢情况研究,对预防和治疗由酒精摄入导致的肝脏疾病有着理论和实际意义。酒精在进入细胞后主要经氧化代谢途径进行降解,酒精主要在乙醇脱氢酶（ADH）和细胞色素酶P450（CYP2E1）作用下氧化分解为乙醛,乙醛在乙醛脱氢酶（ALDH2）作用下氧化为乙酸,乙酸进一步进入能量循环继而氧化分解。在酒精的代谢过程中,乙醛的产生和积累会伴随乙醛加合物的产生,这些加合物可通过脂质过氧化过程引起线粒体膜和细胞膜的破坏,使细胞形态出现改变,同时乙醛也会造成DNA损伤。乙酸分解后产生的氧自由基可引起ROS水平的升高,造成DNA损伤。因此,细胞中乙醛的代谢是酒精代谢中非常重要的一个环节之一。核转录因子NF-E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,NFE2L2,Nrf2）在维持机体氧化还原平衡中发挥着重要作用,同时在细胞各项生命活动中也承担着重要的作用,近年来被广泛研究。此前的研究中主要围绕Nrf2作为酒精暴露后细胞氧化应激相关生物因子进行研究,或是将参与酒精氧化代谢相关酶进行敲除后探讨Nrf2的改变。本文通过建立肝细胞特异性Nrf2基因敲除小鼠模型,给予不同酒精暴露方式,旨在以Nrf2为中心探讨其在酒精代谢过程中的作用,补充Nrf2在肝细胞酒精代谢过程中的作用及机制,为预防和治疗酒精性肝病提供实验依据和理论基础。研究方法:1、肝细胞特异性Nrf2敲除小鼠给予6周酒精液体饲料酒精暴露模型:应用Nrf2-Lox P与Albumin-Cre工具鼠杂交获得肝细胞特异性Nrf2敲除（Nrf2（L）-KO）小鼠及同窝出生的对照组（Nrf2-Lox P）小鼠。选取12-16周龄的Nrf2-Lox P与Nrf2（L）-KO雄性小鼠,每组6-8只:对照液体饲料Nrf2-Lox P组（Nrf2-Lox P,Liber De Carli Control）和对照液体饲料Nrf2（L）-KO组（Nrf2（L）-KO,Liber De Carli Control）,4.2%酒精液体饲料Nrf2-Lox P组（Nrf2-Lox P,Liber De Carli）和4.2%酒精液体饲料Nrf2（L）-KO组（Nrf2（L）-KO,Liber De Carli）。4.2%酒精液体饲料暴露6周,实验期间各组小鼠均给予液体饲料,对照组为对照液体饲料。实验期间小鼠自由活动并摄入食物,不额外补充水源,暴露6周后对小鼠禁食12h收取小鼠肝组织。2、肝细胞特异性Nrf2敲除小鼠给予6周33%乙醇水溶液灌胃暴露模型:同上述实验分组,每日定时称量体重并进行灌胃处理,对照组小鼠使用PBS缓冲溶液进行灌胃,实验组使用33%乙醇水溶液进行灌胃。灌胃后1～3h内观察动物醉酒及恢复情况至第6周。在暴露7天时对照组与实验组小鼠均进行33%乙醇水溶液灌胃,使用尾尖采血法收集小鼠0h、2h、4h、6h、8h血液用于顶空气相色谱法检测血液中乙醇、乙醛含量。在第6周对照组和实验组小鼠均进行酒精灌胃操作,灌胃6h后收取小鼠组织以检测相关指标。3、实验样品处理:肝组织获得后取部分组织4%多聚甲醛固定,用于H＆E染色;剩余肝组织冻存,部分组织用于总RNA提取,逆转录获得c DNA后检测肝细胞中Nrf2表达水平;使用冻存肝组织提取总蛋白,对涉及乙醇、乙醛氧化代谢相关酶及细胞乙酰化水平进行蛋白水平检测;收取血液和对肝组织进行研磨,使用顶空气相色谱法对血液及组织中乙醇、乙醛含量进行检测。结果:1、酒精液体饲料暴露小鼠肝脏均出现程度相当的肝组织损伤,肝细胞组织形态发生改变,组织间固定结构消失,排列混乱,肝细胞出现体积增大同时胞浆透明的气球样变化,细胞中出现类似脂滴物质,对照组与暴露组及组内对照肝细胞脂肪变性水平相似,未表现出显著差异。2、酒精液体饲料暴露小鼠模型肝细胞中乙醇脱氢酶（ADH）和细胞色素P450（CYP2E1）蛋白水平在酒精液体饲料组中出现升高。肝细胞乙醛脱氢酶ALDH1A1与ALDH2在酒精暴露组中出现差异,Nrf2（L）-KO小鼠与组内Nrf2-Lox P对照相比乙醛脱氢酶蛋白水平下降。3、33%乙醇水溶液灌胃暴露模型小鼠,Nrf2（L）-KO小鼠体重出现下降,乙醇水溶液暴露组与对照组相比血糖未出现明显差异,脏器系数无明显变化。4、33%乙醇水溶液灌胃暴露模型小鼠,连续乙醇暴露组血液中乙醇含量降低速率高于单次乙醇暴露组。肝组织中乙醇含量在连续暴露组与单次暴露组件未表现出差异,连续暴露组乙醛含量明显低于单次暴露组。酒精液体饲料暴露模型小鼠,肝组织乙醇含量在Nrf2（L）-KO小鼠与Nrf2-Lox P小鼠间未观察到差异,乙醛含量Nrf2（L）-KO小鼠高于Nrf2-Lox P小鼠。结论:酒精暴露对肝脏组织造成不同程度的损伤,如肝脏结构破坏和脂质蓄积等,本研究发现肝细胞Nrf2参与小鼠酒精代谢调控。1、酒精液体饲料暴露诱导乙醛脱氢酶水平升高;在肝细胞Nrf2缺失条件下,上述诱导能力减低。2、肝细胞Nrf2缺失影响小鼠酒精代谢模式,进而影响肝脏组织蛋白的乙酰化水平。