紫杉醇是最早发现于红豆杉属植物中的一个二萜生物碱类化合物。现已被开发为临床一线抗肿瘤药物,对多种癌症具有良好疗效,市场需求量大。红豆杉属植物稀少,生长缓慢,且紫杉醇含量极低,市场供需矛盾剧烈。目前紫杉醇主要依靠植物提取或化学半合成获得,寻找新的紫杉醇获取方式一直是研究学者们关注的焦点。近年来,合成生物学的迅速发展为紫杉醇提供一种潜在的新获得方式。紫杉醇生物合成途径尚未完全解析,增加了其异源合成的难度,紫杉醇侧链C2’-羟化酶T2’H的未知性是以巴卡亭III为底物异源半合成紫杉醇的唯一障碍。T2’H的功能挖掘可以为在微生物中重构紫杉醇侧链合成途径提供物质基础,进而为紫杉醇提供新的来源方式。本研究对曼地亚红豆杉悬浮培养的细胞,进行动态检测细胞紫杉烷代谢物的水平,对关键时间节点的培养细胞进行二代转录组测序。通过差异转录分析获得候选基因,并在酿酒酵母中进行表达及体外功能表征。同时,通过Biobrick方法将紫杉醇侧链已知基因进行组装,重构紫杉醇侧链的合成途径,为大肠杆菌异源半合成紫杉醇提供平台。主要研究结果如下:（1）红豆杉悬浮细胞在生长周期的第4天开始用茉莉酸甲酯诱导,经检测诱导培养液中的紫杉烷类化合物在第16天至21天紫杉醇生成量明显提高,在生长周期的第28天紫杉醇积累量达最大值25.2 mg/L。（2）取诱导后的10个不同时间节点的悬浮细胞进行二代转录组测序,将所有序列进行混拼并注释。经注释后转录组中P450单加氧酶unigene有299条,通过时间动态变化趋势与经茉莉酸甲酯诱导后表达量明显上升的P450 unigene 128条。再以已报道紫杉醇母核修饰基因为诱饵进行聚类分析,筛选获得unigene 27条。系统进化树分析显示,仅unigene C42822/f1p2/1399与黄酮F6H在单独分支上,而其余26条unigene与T2H,T7H或T10H在同一分支上,可作为候选基因继续进行后续研究。从培养细胞中克隆候选基因,构建相关表达载体并转入WAT11中进行异源表达。通过重组酵母菌微粒体制备及体外酶活检测,没有发现能够催化N-去苯甲酰-2’-脱氧紫杉醇的单氧化酶。（3）根据NCBI数据库报道的PAM,PCA,BAPT,DBTNBT序列设计引物,克隆获得紫杉醇侧链合成已知基因。通过Biobrick方法,组装紫杉醇侧链合成途径基因,获得重组大肠杆菌表达质粒p ET21c-PPBD。以巴卡亭III为原料,在LB培养基中添加0.5 m M苯丙氨酸,通过4天的发酵,检测没有获得紫杉醇结构类似物。随后分别在体内和体外对PCA进行功能验证,没有发现活性。综上所述,本工作着眼于紫杉醇的微生物法半合成,通过对红豆杉培养细胞的动态转录组测序及差异表达分析,获得了24条候选基因并在酿酒酵母中实现了全部基因的表达,遗憾的是并未发现具有N-去苯甲酰-2’-脱氧紫杉醇催化活性的单加氧酶,对表达紫杉醇侧链的合成途径重组菌发酵也未发现紫杉醇的结构类似物产生。本工作的研究方法和思路对紫杉醇的异源合成提供新的方向。