小RNA介导的基因表达调控在植物生长发育过程中发挥着重要的功能,Argonaute(AGO)蛋白是小RNA介导基因表达沉默通路的重要功能蛋白,广泛参与了植物的生长发育调控和生物及非生物的抗逆胁迫响应。小麦是重要的粮食作物,具有异源六倍体基因组,目前,小麦中AGO的研究报道仍然较少,系统分析小麦中AGO基因家族成员。探讨其在小麦生长发育过程中的表达特性,并通过VIGS介导的基因沉默初步开展了小麦AGO的功能研究,这为深入探讨AGO参与的基因表达调控以及在小麦生长发育中生物学功能奠定基础。主要研究结果如下:1.利用生物信息学方法成功鉴定了小麦TaAGO家族的17个成员,并分析了每个成员的A,B,D同源序列。染色体定位显示,这17个基因(54个部分同源位点)分布在小麦的7个染色体群上,其中分布于第2、6、7染色群上的AGO成员最多,分别为5/3/4个(15、9和11个部分同源位点)基因,TaAGO1b的三个部分同源基因定位在7AS,7DS和4AL上,推测在进化中7BS和4AL之间发生了染色体易位。基因组结构分析发现,小麦TaAGO家族基因的内含子数量大多集中在20~23个之间,其中TaAGO2a、TaAGO2b、TaAGO7只包含2个内含子。在同一个TaAGO的三个部分同源位点在基因组结构上也存在差异,例如TaAGO10a-7A和TaAGO10a-7D的内含子数量为22、而TaAGO10a-7B的内含子是21个,进一步分析发现TaAGO10a-7B、TaAGO10a-7D的第一内含子的大小为8161 bp、7543 bp远大于TaAGO10a-7A的92 bp,不过TaAGO10a的三个部分同源基因编码的氨基酸序列同源性极高,TaAGO10a-7A与TaAGO10a-7B的氨基酸相似度为94.4%,与TaAGO10a-7D的相似性为96.7%,TaAGO10a三个部分同源基因的第一内含子的大小差异是否与其表达调控有关有待于进一步的研究。小麦中的17个TaAGO蛋白长度在692~1192个氨基酸之间,预测蛋白分子量在78.40 Kda~131.42 KDa之间,等点电在8.64~10.05之间,所有的TaAGO蛋白均为亲水性蛋白。亚细胞定位显示,17个TaAGO蛋白有15个被定位于细胞质、细胞核中,而另外两2个AGO蛋白TaAGO10a、TaAGO10b被定位在细胞质和线粒体中。2.系统进化树和聚类分析显示,小麦的TaAGO家族成员与拟南芥中AGO基因家族分类(拟南芥AGO被分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个进化枝)一致也可以分为三个亚类,其中a亚类包括10个成员(TaAGO1a、TaAGO1b、TaAGO1c、TaAGO1d、TaAGO5a、TaAGO5b、TaAGO5c、TaAGO10a、TaAGO10b、TaAGO18),b亚类有3个成员(TaAGO2a、TaAGO2b、TaAGO7);c亚类有4个成员(TaAGO4a、TaAGO4c、TaAGO4b、TaAGO6),表明AGO家族进化上在单子叶和双子叶植物之间没有差异。3.17个TaAGO的54个部分同源位点组织表达特性分析显示,10个TaAGO的27个部分同源位点(TaAGO1c-6A/-6D、TaAGO1b-2A/-2B/-4A/-7A/-7D、TaAGO1d-7A/-7A/-7D、TaAGO4c-1A/-1B/-1D、TaAGO2a-2A/-2B、TaAGO2b-2A/-2B/-2D、TaAGO4b-7D、TaAGO4a-3A/-3B/-3D、TaAGO6-5A/-5B/-5D、TaAGO10a-7B/-7A)在种子、幼穗、叶片、根和茎中在表达量均较高。TaAGO1a的3个同源位点(TaAGO1a-6A/-6B/-6D)在根中表达量最高;4个家族成员的7个位点(TaAGO1b-2D、TaAGO2a-2D、TaAGO5c-5A/-5B/-5D、TaAGO10b-6A/-6B)只在穗中表达;而2个家族成员TaAGO5b(TaAGO5b-2A/-2B/-2D)、TaAGO18(TaAGO18-3A/-3B/-3D)在种子中表达量最高,在穗中表达量较低,推测不同的家族成员可能在小麦不同组织中发挥功能。4.以京841为材料扩增到了TaAGO1b、TaAGO4a的c DNA全长,并且对TaAGO1b、TaAGO4a的三个部分同源基因进行了分离鉴定。TaAGO1b-4A、TaAGO1b-7A、TaAGO7D基因结构相似,均含有21个内含子,ORF大小为2607 bp,编码868个氨基酸。预测蛋白分子量分别为97.93Kda、97.89Kda,97.87Kda,等电点分别为9.31、9.28、9.31。氨基酸序列比对结果显示,京841与中国春TaAGO1b基因编码的氨基酸序列相似性为98.5%,存在11个氨基酸差异。与中国春序列相比京841中TaAGO1b-4A在第13、479、770位氨基酸存在差异,TaAGO1b-7A在第3、158、179、441、546位氨基酸存在差异,TaAGO1b-7A在第334、410位氨基酸存在差异。TaAGO4a-3A和TaAGO4a-3D在基因组上均含有20个内含子,TaAGO4a-3A基因全长为3040 bp,ORF大小为2748 bp,编码915个氨基酸,预测蛋白分子量为101.77 KDa,等电点为9.05;TaAGO4a-3D基因全长为3012 bp,ORF大小为2751 bp,编码916个氨基酸,预测蛋白分子量为101.93Kda,等电点为9.06。氨基酸序列比对显示,两个小麦品种中TaAGO4a的相似性为99%,与中国春序列相比京841中TaAGO4a-3A在第5、13、178、423位氨基酸存在差异。京841中TaAGO4a-3D与TaAGO4a-3A相比缺少一个脯氨酸(P)。保守结构域分析显示TaAGO1b具有AGO家族典型的保守结构域PAZ(207~321)、PIWI(497~818)。TaAGO4a的PAZ保守结构域在第324~399位氨基酸,PIWI保守结构域在568~875位氨基酸。5.种子萌发过程的表达特性分析显示,TaAGO1b在京841和中国春两个品种的同一组织中(胚、胚乳)具有相似的表达模式。胚中的TaAGO1b在6 h、24 h、72 h三个时期高表达,胚乳中TaAGO1b在12 h、48 h高表达。TaAGO1b的三个部分同源基因中TaAGO1b-7D的表达量最高,TaAGO1b-4A与TaAGO1b-7A的表达量较低,推测TaAGO1b-7D在种子萌发中发挥更主要的作用。总体上看来,TaAGO1b在种子萌发过程中表达上调,可能参与了种子的萌发过程;TaAGO4a在两个小麦品种中具有不同的表达模式。京841中TaAGO4a基因在胚和胚乳中的表达模式较为相近,在6 h~24 h表达持续表达上调,之后的时间里维持高表达趋势。在中国春的胚中,TaAGO4a在种子萌发前期高表达,胚乳中TaAGO4a在种子萌发后期表达量较高。TaAGO4a在两个品种中均表现出差异表达的现象,推测TaAGO4a可能在种子的萌发过程中发挥了一定调控功能,不同品种间的表达差异可能与小麦品种特性有关。TaAGO4a的三个部分同源基因的表达量也存在差异,京841中TaAGO4a-3D表达量最大,中国春中TaAGO4a-3B的表达量最大,表明部分同源基因在种子萌发过程中可能发挥着不同的功能。春化过程中的表达特性分析显示,京841TaAGO1b的上调表达集中在处理的中后期,24 d时表达量达到最大为对照的6.4倍。中国春中TaAGO1b的表达上调更集中在春化处理的前中期,15 d时表大量最大为对照的21倍;TaAGO4a在俩个品种中的表达模式不尽相同,在京841中从6 d开始整体呈上调趋势,在21 d~27 d达到最高。而中国春在春化处理前期表达量上调较快,21 d时达到最高,之后表达量迅速下调。整体上看来TaAGO1b、TaAGO4a在春麦中的响应速度较快,基因上调表达持续时间较长但是上调量少于冬麦。这种春化响应差异表明TaAGO1b、TaAGO4a在春化过程中发挥着重要功能。6.成功构建了TaAGO1b和TaAGO4a基于大麦条斑花叶病毒(BSMV)的VIGS载体。以体外转录的方式大量产生病毒重组载体并使用涂抹的方法接种小麦幼苗。接种7天后观察到接种了TaPDS抑制表达载体的植株出现了明显的光漂白现象。实时荧光定量证明接种7天时内源TaPDS基因表达量降低为对照的0.74倍,TaAGO1b降低为对照的0.8倍,TaAGO4a降为对照的0.75倍;21天时TaPDS表达量降低为对照的0.38倍,TaAGO1b降低为对照的0.59倍,TaAGO4a降为对照的0.6倍,在转录水平上证明了TaAGO1b、TaAGO4a内源基因被成功抑制表达。在表型观察中由于接种了TaAGO1b和TaAGO4a抑制表达载体植株还没有观察到表型异常,相关实验正在进一步开展中。为了更深入的了解TaAGO1b和TaAGO4a在小麦生长发育进程中中参与的生理生化机制,我们构建了TaAGO1b和TaAGO4a的RNA干扰载体,使用农杆菌介导的方法对小麦茎尖进行遗传转化,成功收获了T0代小麦种子,现阶段对T1代阳性植株的分子鉴定筛选工作仍在紧张进行中。