柑橘大实蝇Bactrocera minax隶属于双翅目,实蝇科,果实蝇属,是一种危害柑橘类水果的寡食性害虫。滞育是昆虫及其近缘节肢动物在特定发育阶段停止发育的一种生理现象在协调生物与环境之间的关系方面起着重要的作用。鉴于滞育机理的复杂性,本研究中以柑橘大实蝇为研究对象,利用转录组与代谢组技术,对柑橘大实蝇滞育型蛹(D)与非滞育型蛹(ND)之间不同阶段的蛹差异进行了比较分析,并进一步研究了TTLL3B基因的分子特性和功能,丰富对柑橘大实蝇滞育机理的进一步理解。本学位论文的主要研究结果如下:1柑橘大实蝇滞育型蛹与非滞育型蛹代谢谱分析采用核磁共振技术研究了柑橘大实蝇滞育型蛹与非滞育型蛹各自在不同时间点之间以及相同时间点上的代谢谱差异。同时,发掘不同对比组合中具有显著差异的代谢物,并分析了这些代谢物的潜在作用。结果显示柑橘大实蝇滞育型蛹在D1、D15和D30这3个时间点中的代谢谱差异显著;在注射了20E后的非滞育蛹中,ND1分别于ND15和ND30代谢谱呈显著差异,但ND15和ND30的代谢谱差异不显著;滞育型蛹与非滞育型蛹在D1-ND1、D15-ND15和D30-ND30这三个时间点中均表现出显著差异。通过计算VIP值明确了21种代谢物对代谢组组间差异贡献最大,其中柠檬酸、葡萄糖、麦芽糖、脯氨酸、海藻糖、谷氨酸、天冬酰胺和N-乙酰谷氨酸出现显著差异的次数最多,且VIP值远远高于其他代谢物。其中,柠檬酸、葡萄糖、麦芽糖、脯氨酸、海藻糖、谷氨酸和天冬酰胺能直接或间接进入三羧酸循环,说明柑橘大实蝇滞育期间能量代谢和物质转化产生了显著的变化。此外,海藻糖、脯氨酸、N-乙酰谷氨酸和肌醇的显著差异有助于调控柑橘大实蝇滞育期间的耐寒性。2柑橘大实蝇滞育型蛹与非滞育型蛹转录组分析利用转录组测序,对柑橘大实蝇不同时间点的滞育型蛹与非滞育型蛹进行测序,得到了15G的数据量,序列数量为108564,长度为356974766bp,N50达到3868bp。将获得的转录本数据与其它功能数据库比对,其中NR中有85494个,GO中有21693中有21693个,KEGG中有6828个,eggNOG中有77828个,Swissprot中有58878个,在所有数据库都被比对到的有4536个序列获得注释。在NR注释中,近源物种同源性分析发现与果实蝇属Bactrocera的同源性最高,占比76.94%;有40.14%的序列相似度达到了60%以上,其中有8.29%的序列相似度高达95%以上。GO数据库中共有21693个序列被成功注释到54个二级分类中,其中细胞过程、结合、催化活性这三类数量最高。KEGG数据库中共有6828个序列被成功注释到33个通路中。其中数量最多的通路为信号传导、其次为翻译。eggNOG分类中共成功注释到77828个,25个二级分类,其中一般功能预测、信号转导机制、翻译后修饰/蛋白质转换/伴随蛋白最多;采用DESeq对基因表达进行差异分析,表明D15-ND15得到的差异表达基因最多,总共有2485个基因发生了显著性变化,上调为621个,下调为1864个;D30-ND30得到的差异表达基因最少,总共只有19个基因,且19个基因全部上调。3柑橘大实蝇滞育型蛹与非滞育型蛹差异基因表达分析在转录组数据的基础上,通过qRT-PCR和半定量PCR分析与滞育高度相关的基因在滞育型蛹整个蛹期的表达模式,筛选出7个可能与滞育高度相关的基因。7个基因分别为Cyp6a9,Fru,KSPI,LYZ1,MSTA,TTLL3B和UC2,qRT-PCR和半定量PCR分析表明滞育型蛹与非滞育型蛹之间存在显著差异。其中,Cyp6a9,Fru,MSTA,TTLL3B和UC2与滞育高度正相关,而KSPI和LYZ1与滞育高度负相关。4柑橘大实蝇TTLL3B基因克隆及序列分析通过RACE技术克隆了TTLL3B基因cDNA全长,分别命名为TTLL3B-1、TTLL3B-2和TTLL3B-3,开放阅读框分别为2097bp、2034和2121bp,编码699、678和707个氨基酸。通过ProtParam预测分析其相对分子质量为80.90kDa、78.56kDa和81.70kDa,理论等电点pI为9.44、9.36和9.44,系统发育分析显示TTLL3B基因和所有的双翅目昆虫的TTLL3B聚为一类。利用qRT-PCR对柑橘大实蝇的蛹以及成虫的不同组织表达水平进行分析,结果表明TTLL3B基因在整个蛹期均有表达,其中TTLL3B-2和TTLL3B-3的表达量变化趋势相似,随着滞育的升高,表达水平逐渐升高,45日蛹至105日蛹表达水平较高,在滞育快要结束时,表达水平逐渐降低。在不同组织中,对于TTLL3B-2而言,脂肪体中的表达量最高,中肠次之。对于TTLL3B-3来说,表皮中的表达量最高,脂肪体和中肠次之。