家蚕追寄蝇（Exorista sorbillans Wiedemann）寄生于家蚕幼虫引起的多化性蚕蛆病危害蚕业生产。目前,对蝇蛆病的防治药剂依然为上世纪60年代推广使用的“灭蚕蝇”,也是迄今为止防治蝇蛆病最有效的药剂。然而,长期使用致使蝇蛆早已对其产生了一定的抗药性。为了寻找新的防治蝇蛆病的方法或药剂,本研究主要从被寄生家蚕早熟的分子机理与家蚕追寄蝇孵化酶特性研究两方面入手,初步阐明两者之间的互作关系,为进一步控制蝇蛆病提供基础;在分子水平上对家蚕追寄蝇孵化酶基因研究可以为以孵化为靶点的新型杀虫剂的开发提供理论基础,同时为农业害虫的生物防治提供新思路和新途径。一、追寄蝇导致寄主家蚕早熟的分子机制:家蚕在被追寄蝇寄生后会出现早熟的现象。家蚕蜕皮与变态发育主要由蜕皮酮（Ecdysone）及其活性代谢产物20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）和保幼激素（Juvenile hormone,JH）等激素的协同调节。为了阐明被追寄蝇寄生的家蚕早熟的分子机制,测定了被寄生家蚕血淋巴中JHⅢ和20E的滴度。JHⅢ和20E的滴度在5龄寄生家蚕体内均有升高。通过RT-q PCR调查参与20E和JH合成、代谢及信号通路相关基因的表达模式。结果表明,被家蚕追寄蝇寄生后,参与20E合成的Nvd、CYP302A1和CYP307A1基因显著上调,同时分别RNAi敲低CYP302A1和CYP307A1基因后降低了20E的浓度,导致家蚕5龄期延长。参与JH合成和代谢的相关基因在寄生家蚕5龄后期幼虫中显著下调,进一步RNAi敲低JHE基因导致JHⅢ浓度升高,寄生家蚕的5龄期经过延长。推测家蚕被寄生后诱导了20E合成途径关键基因的上调表达,导致体内的蜕皮激素显著升高,同时诱导JH代谢途径中关键基因的下调表达,导致JHⅢ在寄生家蚕的5龄后期显著升高,最终在这两种激素的共同作用下导致了家蚕的早熟。这为进一步了解家蚕对寄生的响应机制提供理论基础。二、家蚕追寄蝇孵化酶基因（EsHE）的克隆与酶学特性分析:1.EsHE基因的克隆与分子特性分析:为从分子水平探究家蚕追寄蝇的孵化机制,以发育1.5 d的蝇卵为材料提取总RNA并反转录合成c DNA,根据双翅目昆虫孵化酶基因的保守序列设计兼并引物,通过RACE技术获得家蚕追寄蝇孵化酶基因的全长c DNA,命名为EsHE（Gen Bank登录号:ON042475）。EsHE基因c DNA全长1518 bp,包含159 bp 5′UTR、423 bp 3′UTR和936 bp的完整ORF,编码312个氨基酸;EsHE氨基酸序列含有孵化酶特征序列HELMHVLGFMHE锌结合基序和YDYGSVMHY Met-转角基序;基于EsHE氨基酸序列与其他21种动物孵化酶同源氨基酸序列构建的系统进化树分析显示,家蚕追寄蝇与丝光绿蝇Lucilia sericata的亲缘关系最近。通过以家蚕追寄蝇基因组DNA为模板扩增EsHE基因的ORF序列克隆获得家蚕追寄蝇内含子。利用Genome Walking技术克隆获得EsHE基因组DNA 5′端启动子序列和3′端下游序列,并通过序列拼接,获得家蚕追寄蝇孵化酶完整的基因组DNA结构。EsHE基因组DNA全长8974 bp,包括2429 bp的上游序列、1005 bp的第1外显子、2638 bp的内含子、501 bp的第2外显子和2401 bp的下游序列。RT-q PCR检测EsHE基因在家蚕追寄蝇胚胎发育36 h时表达水平开始大幅上升,至孵化前的第48 h达到最高水平,说明EsHE与家蚕追寄蝇的胚胎发育和孵化密切相关;EsHE基因在3龄幼虫的高度表达,从而暗示了EsHE基因还有可能发挥溶茧酶的作用,帮助软化茧壳,有利于蝇蛆从茧壳中钻出。生物信息学预测EsHE上游启动子序列含有与胚胎发育相关的转录因子GATAd和HSF。上述研究结果为进一步阐明家蚕追寄蝇孵化分子机理奠定了基础,以孵化相关基因作为靶点的杀虫剂研究开发提供理论基础。2.EsHE的酶学特性:体外表达EsHE蛋白发现,EsHE蛋白主要以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。经纯化、复性后的三种类型的EsHE,通过检测其对酪蛋白、动物孵化酶特异性底物Leu-Leu-Glu-MCA氨基酸肽链的降解活性,成熟酶EsHEb的降解活性最高。EsHEb的最适降解卵壳的温度为40℃,最适降解卵壳的p H值为7.0。EsHEb对酪蛋白的Km值为8.913 mg/m L。针对纯化后EsHEb蛋白的水解作用,考察了不同蛋白酶抑制剂对其活性的影响。结果表明,5,5′-二甲基-2,2′-联吡啶显著抑制了EsHEb活性,抑制率达到82.9%。最后分别以家蚕追寄蝇卵壳、家蚕丝胶茧壳作为底物,检测原核表达纯化产物EsHEb对自然底物的降解活性。结果表明,EsHEb对家蚕追寄蝇卵壳、家蚕丝胶茧壳的降解活性分别为343.44±78.56、223.48±13.11ΔA280 10-3min-1mg-1,表明EsHE参与了家蚕追寄蝇的孵化过程,同时还有可能发挥溶解家蚕茧壳的功能。3.孵化酶抑制剂——联吡啶在家蚕蝇蛆病防治中的应用探索:根据联吡啶本身所具有的特点（即对金属离子的螯合特性）与家蚕追寄蝇寄生家蚕的特性（即卵到幼虫的蜕变需经历“孵化”这一过程）相结合,联吡啶能显著抑制EsHEb活性,对联吡啶在家蚕蝇蛆病的应用工艺进行了初步研究。试验结果表明,0.5～3 m M联吡啶对家蚕蝇蛆病的治疗效果可以达到90%～100%,高于“灭蚕蝇”对蝇蛆病的治疗效果（83.4%）。对2m M浓度的联吡啶通过浸渍和体喷结合、浸渍、体喷和添食这四种处理方法对蝇蛆病均有一定的治疗效果,其中以浸渍和体喷结合为最佳施药方式。联吡啶防治蝇蛆病的药物处理的最佳用药时期为家蚕追寄蝇产卵后0～36小时。0.5～2m M联吡啶处理对家蚕生命力等安全,还能相应延长家蚕五龄期经过,进而提高家蚕的全茧量与茧层量,增加养蚕业的经济效率。因而联吡啶在防治家蚕蝇蛆病中极具应用前景。