实验目的人体肠道是开放式腔道,其内部定植有大量微生物,其中主要是细菌,一般被统称为肠道菌群。它们与人体经过长期相互选择和共同进化,彼此间形成了互利共生的关系,人体为它们提供合适的生存环境,它们也参与宿主的物质代谢和免疫防御,形成了一个相对稳定的状态,对人体的健康起着重要作用。过量使用抗生素会造成肠道菌群失调,导致许多疾病的发生,已有不少相关报道。根据传统中医理论,长期大量使用清热解毒苦寒中药会损伤脾胃,耗伤正气,苦寒中药在临床使用广泛,具有清热解毒消炎杀菌等作用。若滥用苦寒中药是否会有类似于抗生素对肠道菌群的破坏作用还鲜见报道。本研究用苦寒中药黄芩的有效成分黄芩苷处理正常小鼠,用传统细菌培养方法和PCR-DGGE方法观察其对小鼠肠道细菌的多样性和菌落结构及益生菌,条件致病菌数量的影响,及肠黏膜的损伤情况等。探讨黄芩苷对肠道菌群的影响规律,以期为苦寒中药的临床合理使用提供实验参考资料。实验方法1.建立盐酸林可霉素造成肠道菌群失调的对照组；不同剂量黄芩苷灌胃小鼠的实验组；生理盐水灌胃的正常组；观察各组小鼠外形,活动,饮食等。14天后断颈椎处死小鼠,取盲肠内容物,提取肠道细菌总DNA,在PCR仪上进行基因扩增,然后进行变形梯度凝胶电泳(DGGE),对结果进行指纹图谱分析,和细菌多样性及物种丰度衡量。2.建立盐酸林可霉素灌胃小鼠的对照组；建立不同剂量黄芩苷灌胃小鼠的实验组；建立生理盐水灌胃的正常组；以上各组又均分为三天、五天、九天、十四天四个不同的实验时间。观察各组小鼠外形,活动,饮食等。在乙醚麻醉下,摘眼球取血,检测淋巴细胞数变化。后断颈椎处死小鼠,取盲肠内容物按照称量,均质化,稀释,滴板涂布,培养计数的流程测定小鼠肠道中双歧杆菌,乳酸杆菌,肠球菌,大肠埃希菌数量,运用SPSS统计软件对各组数据进行分析。取小鼠回肠制作病理切片,HE染色,光镜下观察各组小鼠肠道情况,并比较组别间的差异。实验结果1. PCR-DGGE技术细菌指纹图谱分析显示：低剂量黄芩苷组肠道细菌多样性指数、物种丰度均高于其他组,林可霉素组肠道细菌多样性指数、物种丰度远低于其他各组。聚类分析的结果显示,生理盐水组、低剂量黄芩苷组、林可霉素组肠道细菌种群组内相似性较高,组间差异性较大,而中剂量黄芩苷组聚类情况不固定,其肠道菌群与其他各组的差异性都较大。2.平板培养计数统计结果(1)大肠埃希菌数量变化三天时,黄芩苷高剂量组和正常组比较大肠埃希菌数量增多,差异明显,有统计学意义(P<0.05)；五天时,黄芩苷低剂量组和正常组比较数量增多,差异有显著统计学意义(P<0.01)；九天时,林可霉素组,黄芩苷低、高剂量组较正常组均数量增多,有统计学意义(P值分别<0.05,0.01,0.01)；十四天时,黄芩苷低、中、高剂量组和林可霉素组均较正常组数量增多,差异有显著统计学意义(P<0.01)；但黄芩苷低、中剂量组增多的数量是另一种大肠埃希菌菌落,该菌落在低剂量组数量较多,在中剂量组数量较少。而黄芩苷高剂量组增多的大肠埃希菌菌落形态、颜色均和正常组、林可霉素组相同。随实验时间增加,林可霉素组大肠埃希菌数量不断增多,两两比较结果显示(见附录4)：十四天时和前三个时间相比,数量增多明显,有统计学意义(P<0.05)；黄芩苷低剂量组,随实验时间增加数量波动变化,最终呈增多趋势,其中三天时数量最少,和后三个时间相比,均有统计学意义(P<0.05)；黄芩苷中剂量组,随实验时间增加,大肠埃希菌数量波动明显,其中十四天时数量最多,和前三个时间相比,有统计学意义(P<0.05)：黄芩苷高剂量组和正常组大肠埃希菌随时间变化较平稳,两组各时间之间比较均无统计学意义。(2)肠球菌数量变化三天时,黄芩苷中、高剂量组和正常组比较,肠球菌数量减少,差异有显著统计学意义(P<0.01)；五天时,黄芩苷中剂量组较正常组数量减少,有显著统计学意义(P<0.01)；九天时,林可霉素组较正常组数量增多,有显著统计学意义(P<0.01),黄芩苷低剂量组较正常组数量减少,差异有统计学意义(P<0.05)；十四天时,林可霉素组,黄芩苷高剂量组较正常组数量增多,有统计学意义(P值分别<0.01,0.05)；黄芩苷中剂量组较正常组数量减少,差异有显著统计学意义(P<0.01)。随实验时间增加,林可霉素组肠球菌数量呈不断增多趋势,其中后三个时间点肠球菌数量均较三天时明显增多,有统计学意义(P<0.05)(见附录4)；高剂量黄芩苷组肠球菌数量呈增多趋势,其中十四天、九天时和三天、五天比较肠球菌数量均明显增多,有统计学意义(P<0.05)；中剂量组肠球菌数量波动明显,其中九天时数量最多,和其他三个时间点比较,差异明显,有统计学意义(P<0.05)；正常组和低剂量组随时间增加,肠球菌数量变化均无统计学意义。(3)双歧杆菌数量变化三天,五天时,各个药物组间双歧杆菌数量变化无统计学意义；九天时,林可霉素组,黄芩苷高剂量组数量减少,和正常组比较,有统计学意义(P值<0.05,0.01)；十四天时,林可霉素组,黄芩苷高剂量组数量减少明显,和正常组比较,有显著统计学意义(P<0.01)。随实验时间增加,林可霉素组双歧杆菌数量不断减少,其中十四天时数量最少,和前三个时间相比,数量减少,有统计学意义(P<0.05)(见附录4)；黄芩苷高剂量组双歧杆菌数量随时间呈减少趋势,后三个时间点和三天时相比,数量减少,有统计学意义(P<0.05)；中剂量组双歧杆菌数量波动变化呈增多趋势,其中十四天时和前三个时间点相比,差异明显,有统计学意义(P<0.05)；正常组双歧杆菌数量变化平稳,低剂量组双歧杆菌数量呈增多趋势,两组各时间点差异均无统计学意义。(4)乳酸杆菌数量变化三天时,各药物组乳酸杆菌数量变化无统计学意义；五天时,林可霉素组,黄芩苷高剂量组乳酸杆菌数量减少,和正常组比较,有统计学意义(P值<0.05,0.01)；九天时,林可霉素组和正常组比较,乳酸杆菌数量减少明显,有统计学意义(P<0.05)；十四天时,林可霉素组,黄芩苷高剂量组乳酸杆菌数量减少,和正常组比较,有统计学意义(P值<0.01,0.05)。随实验时间增加,林可霉素组乳酸杆菌数量不断减少,其中十四天数量最少和三天相比,乳酸杆菌数量减少明显,有统计学意义(P<0.05)(见附录4)；黄芩苷低剂量组乳酸杆菌数量呈增多趋势,其中后三个时间点和三天时相比,乳酸杆菌数量均明显增多,有统计学意义(P<0.05)；高剂量组乳酸杆菌数量波动明显最终呈减少趋势,其中三天时数量最多,和后三个时间点比较,均差异明显,有统计学意义(P<0.05)；正常组乳酸杆菌数量变化平稳,中剂量组乳酸杆菌数量波动变化最终呈增多趋势,但两组各时间点差异均无统计学意义。3.肠道病理切片光镜下观察示：正常组回肠结构完整；低剂量黄芩苷组回肠结构正常,黏膜上皮完整,腺体排列整齐,绒毛丰富；随实验时间增加,中剂量黄芩苷组从九天开始出现回肠黏膜变薄,上皮部分脱落,绒毛减少变短。高剂量黄芩苷组和林可霉素组回肠黏膜逐渐变薄,间质轻度充血,上皮脱落,杯状细胞数减少,绒毛脱落。4.淋巴细胞数统计结果三天、五天时,各药物组淋巴细胞数比较变化无统计学意义；九天时,林可霉素组,高剂量黄芩苷组淋巴细胞数减少,和正常组比较,有统计学意义(P值<0.01,0.05)；十四天时,林可霉素组,高剂量黄芩苷组和正常组比较,淋巴细胞数减少,差异有显著统计学意义(P<0.01)。随实验时间增加,林可霉素组淋巴细胞数逐渐减少；黄芩苷低、中剂量组淋巴细胞数呈增多趋势；正常组淋巴细胞数变化平稳；但以上四组随实验时间增加淋巴细胞数变化均无统计学意义。高剂量黄芩苷组淋巴细胞数呈减少趋势,其中九天、十四天时和五天、三天比较,淋巴细胞数减少明显,有统计学意义(P<0.05)(见附录4)。实验结论1.黄芩苷低剂量组肠道结构正常,菌群多样性指数和物种丰度最高,菌群群落结构稳定,有益菌数量增多,条件致病菌肠球菌数量略减,且能诱导出新的菌群出现,提示其可调节肠道菌群平衡并促使形成新的,更稳定的肠道菌落结构。2.黄芩昔高剂量组出现类似林可霉素组菌群失调现象和肠道损伤表现,黄芩苷中剂量组出现菌群群落结构不稳状态,实验后期有肠道损伤情况,提示长期大量使用黄芩苷或许有类似盐酸林可霉素的破坏作用。