作为人类最早发现的传染病之一,结核病严重威胁着人类健康,尤其是近年来随着耐药性菌株的出现以及结核病-HIV共感染情况增多,结核病又有卷土再重来之势。同时,结核病作为一种重大人兽共患病,严重威胁着动物健康、食品安全和环境安全。细菌的非编码调控小RNA（Small Non-coding Regulatory RNA,sRNA）作为近年来发现的具有重要调控功能的转录后水平调控因子,已经被证实能够对细菌在代谢途径、毒力基因表达、宿主细胞内环境适应以及逃避宿主免疫清除等多个方面产生调控作用,这些过程对于帮助细菌在宿主细胞内成功存活并形成持续感染非常地重要。相比于真核生物的非编码RNA研究进展,有关细菌sRNA的研究近年来才刚刚开始,而人们对结核分枝杆菌的sRNA研究更少,仍有大量的结核分支杆菌sRNA没有被发现,并且迄今为止仅发现一个被鉴定具有明确靶基因的结核分枝杆菌sRNA。本实验室前期从牛结核病牛的肺组织中分离获得1株牛源结核分枝杆菌1458株（Mycobacterium tuberculosis strain 1458,Mtb 1458）,并对感染巨噬细胞24小时的1458株胞内菌与胞外菌进行了RNA-Seq测序。本研究在前期工作基础上,基于RNA-Seq数据,拟发现鉴定新的结核分枝杆菌1458株的sRNA,并进行深度信息挖掘,为后续结核分枝杆菌sRNA调控功能的研究奠定基础。主要取得如下结果:1.结合生物信息学研究手段与分子生物学实验验证,共发现了541条sRNA,其中220条sRNA属于Mtb感染巨噬细胞24小时后的胞外菌,新发现的sRNA占86.8%;321条属于Mtb感染巨噬细胞24小时后的胞内菌,新发现的sRNA占97.2%,。2.Mtb感染巨噬细胞24小时后胞外菌中antisense与intergenic sRNA数量分别130条与90条,分别占胞外菌sRNA总数的59%和41%;Mtb感染巨噬细胞24小时后胞内菌中antisense与intergenic sRNA数量分别为227条与94条,分别占胞内菌sRNA总数的71%和29%。3.对获得的全部sRNA进行了非编码RNA注释,其中Mtb感染巨噬细胞24小时后胞外菌sRNA获得注释29条,占胞外菌sRNA总数的13.2%,其中获得注释antisense sRNA和intergenic sRNA数量分别为5和24条,各占已注释sRNA的17%和83%;Mtb感染巨噬细胞24小时后胞内菌sRNA获得注释9条,占胞内菌sRNA总数的0.3%,并且获得注释的sRNA全部为intergenic sRNA。4.通过对两实验组sRNA进行比对,发现Mtb感染巨噬细胞24小时后胞外菌与胞内菌有大量的sRNA具有保守的区域。又对荧光定量验证的十三条sRNA进行了物种间sRNA同源性分析,发现测序获得的部分sRNA在分支杆菌属中高度同源。5.因为sRNA在Mtb感染巨噬细胞24小时后的胞内、外菌间保守性高,所以对胞外菌的sRNA进行研究与对研究胞内菌sRNA进行研究具有同样价值,可以为后续胞内菌sRNA基因调控功能研究提供有力理论依据;并且实验鉴定胞外菌sRNA相对比直接鉴定胞内菌sRNA容易,所以选择Mtb感染巨噬细胞24小时后的胞外菌sRNA进行后续生物信息学分析与实验验证。经对24小时胞外菌的靶基因预测,并对靶基因进行GO与KEGG pathway富集分析,得到了sRNA潜在调控的靶基因与sRNA可能参与调控的生物途径,进一步构建了sRNA-pathway网络。6.利用荧光定量PCR技术对靶基因结合自由能评分表现特别突出的14条Mtb感染巨噬细胞24小时胞外菌sRNA进行了鉴定,其中鉴定成功13条,表达量趋势与RNA-Seq测序数据一致。综上所述,本研究发现并鉴定了一批结核分枝杆菌sRNA,预测了sRNA的潜在调控功能,构建了sRNA与潜在的调控通路及靶基因之间的网络关系,为后续的结核分支杆菌1458株sRNA功能研究提供了明确的研究方向和坚实的研究基础。