【摘 要】
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目的:复方鳖甲软肝片是国家食品药品监督管理总局批准的首个用于治疗肝纤维化的中成药。目前已有该药用于治疗肝癌的相关临床报道,然而,其作用机制尚不明确。竞争内源性RNA（Competing endogenous RNAs,ceRNA）在肝癌发生、发展中发挥着重要作用。但其与“肝纤维化-肝癌”恶性进展及与复方鳖甲软肝片抗肝癌机制的相关性尚未见报道。因此,本研究旨在从ceRNA调控原理切入,研究复方鳖甲软
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目的:复方鳖甲软肝片是国家食品药品监督管理总局批准的首个用于治疗肝纤维化的中成药。目前已有该药用于治疗肝癌的相关临床报道,然而,其作用机制尚不明确。竞争内源性RNA（Competing endogenous RNAs,ceRNA）在肝癌发生、发展中发挥着重要作用。但其与“肝纤维化-肝癌”恶性进展及与复方鳖甲软肝片抗肝癌机制的相关性尚未见报道。因此,本研究旨在从ceRNA调控原理切入,研究复方鳖甲软肝片干预“肝纤维化-肝癌”恶性进展的作用机制。方法:利用临床来源的成对肝癌组织及邻近非癌肝脏组织,开展微阵列转录组表达谱检测和差异数据分析,获得与肝癌发生相关且具有差异表达特征的长链非编码RNA（Long no coding RNA,lncRNA）、微小RNA（micro RNA,miRNA）和mRNA（Message·RNA,mRNA）。结合生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验,筛选与肝癌发生相关的ceRNA调控轴,并进行目标RNAs表达量的实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）检测。再利用TCGA数据库中的肝细胞癌数据集和本课题组收集到的肝癌临床队列,针对目标RNAs表达量与肝癌患者的临床病理学相关性进行统计分析。进一步,利用两种人源肝癌细胞株（HUH7和MHCC97H）开展了正向和反向实验,考察目标ceRNA调控轴对肝癌细胞恶性行为（细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡、细胞周期）的调控作用。最终,通过构建肝原位癌裸鼠模型和二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）诱导型肝纤维化肝癌大鼠模型,考察复方鳖甲软肝片对肝癌进展的干预潜能,以及对目标ceRNA调控轴中相关RNAs表达量的调控作用。结果:与癌旁肝脏组织相比,临床患者肝癌组织中的miR-328-3p表达量显著降低,而SRSF9 mRNA的表达量则显著升高（均P＜0.05）。通过miRNA靶RNA预测可知,lncRNA·TUG1和SRSF9 mRNA具有与miR-328-3p相同的结合位点,并在双荧光素酶报告基因实验结果中得以验证。基于TCGA数据集和本课题组肝癌临床队列的临床相关性分析结果均表明,SRSF9 mRNA和lncRNA·TUG1高表达肝癌患者的总体生存期和无病生存期均显著短于两基因低表达患者,预示着不良预后（均P＜0.05）。体外实验结果显示,敲低SRSF9 mRNA表达和高表达miR-328-3p均可明显抑制肝癌细胞的增殖、迁移、细胞周期并诱导细胞凋亡,而高表达SRSF9 mRNA则可逆转miR-328-3p的抑癌作用;进而,共转染lncRNA和miR-328-3p的细胞实验表明,lncRNA·TUG1可作为ceRNA,与SRSF9 mRNA竞争性结合miR-328-3p。进一步,经复方鳖甲软肝片干预后,原位癌裸鼠及DEN大鼠模型的肝脏病理改变均得以改善;ELISA、qPCR、免疫组织化学染色和免疫荧光原位杂交检测结果均显示,在发挥抗肝癌药效的同时,复方鳖甲软肝片可有效纠正lncRNA·TUG1、miRNA-328-3p和SRSF9 mRNA的异常表达（均P＜0.05）。结论:复方鳖甲软肝片通过调控lncRNA·TUG1-miRNA-328-3p-SRSF9 mRNA ceRNA调控轴发挥干预“肝纤维化-肝癌”恶性转化的潜能。
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