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超广谱β-内酰胺酶(extented spectrumβ-lactamases,ESBLs)是细菌对三代头孢耐药的主要机制,大肠埃希菌是ESBLs最主要的产生菌。ESBLs基因型有多种,近十年来,CTX-M型已逐渐代替TEM型和SHV型而成为散播最为广泛的基因型。本试验旨在通过检测不同来源鸡源大肠埃希菌(分离自市售健康鸡肉和疑似大肠埃希菌病死亡的病死鸡肝脏)中CTX-M型ESBLs的分子流行特征基础上,分析不同来源、不同亚群的blaCTX-M散播机制及遗传背景,以期为临床控制blaCTX-M的散播及防治产CTX-M型鸡大肠埃希菌感染提供理论基础。用微量肉汤稀释法测定106株鸡大肠埃希菌(包括18株鸡肉分离菌和88株病料分离菌)对氨苄西林、头孢噻呋、头孢噻肟、庆大霉素、阿米卡星、多西环素、氟苯尼考和恩诺沙星8种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),结果显示不同来源分离菌对药物的耐药特征相似,耐药率均在18.2~94.4%。76株对三代头孢耐药的鸡大肠埃希菌(包括10株鸡肉分离菌和66株病料分离菌)的ESBLs检测结果表明:10株鸡肉分离菌中有5株菌携带blaCTX-M,检出率为50%,其中4株为CTX-M-9亚群(3株blaCTX-M-14和1株blaCTX-M-65),1株为CTX-M-1亚群(1株blaCTX-M-55)。66株病料分离菌中有63株菌携带blaCTX-M,检出率高达95.5%,其中属于CTX-M-9亚群有25株(21株blaCTX-M-65和4株blaCTX-M-14)、CTX-M-1亚群有23株(22株blaCTX-M-55和1株bla CTX-M-15)、两种不同亚群杂合的有7株(4株blaCTX-M-64和3株bla CTX-M-123),此外尚有8株分离菌未确定具体的基因亚型。说明目前河南省鸡大肠埃希菌中携带的CTX-M基因主要属于CTX-M-9亚群和CTX-M-1亚群。采用PCR定位技术检测不同亚群的blaCTX-M上、下游基因序列。结果显示:不同亚群的blaCTX-M上游均含有ISEcp1,但下游插入序列不同,其中CTX-M-1亚群、blaCTX-M-64和blaCTX-M-123的下游为ORF477,CTX-M-9的下游为IS903。此外,结果表明在CTX-M-9亚群中有高达80.5%的ISEcp1被其他插入序列截断,而CTX-M-1亚群中,仅有12.5%的ISEcp1被IS26所截断;说明CTX-M-9亚群的上、下游插入序列更易被IS26、IS10和其他未知插入序列截断,且下游插入序列结构更复杂,其末端经常有1个18bp的反向重复序列(IRL)。质粒不相容群结果显示本批受试菌共检出13种质粒复制子类型,其中有67株菌(91.8%,67/73)的质粒复制子类型不低于3种。不同blaCTX-M亚群的菌株携带质粒复制子类型基本一致,且鸡肉分离菌和病料分离菌携带的质粒复制子无明显差异。均为IncFII、IncK和IncFIB的检出率最高,达82%~86%,均未检出IncX、IncL/M、IncW、IncY和Inc FrepB复制子。说明本批受试菌多数均携带有多个质粒复制子,有助于提高质粒的宿主适应性和耐药基因的散播。结果显示13株原保存菌与55株病料分离菌携带的复制子差异较明显,其中IncFIA、IncA/C和IncT仅在病料分离菌中检出,而IncI1和IncB在前者中的检测率明显高于后者。质粒接合试验结果表明,63.0%(46/73)的产blaCTX-M菌株可以成功将耐三代头孢菌素的耐药质粒传递给受体菌J53,其中5株鸡肉分离菌的质粒均全部发生了传递,13株原保存菌中有9株菌质粒发生了接合,接合率为69.2%;55株病料分离菌中有32株菌质粒发生了接合,接合率为58.2%,三者之间无明显差异。说明接合性质粒在CTX-M散播中发挥了重要的作用。种系发育分型的结果显示,73株产blaCTX-M的大肠埃希菌中,种系发育群A、B1、B2和D类的菌株比例分别为31.5%、46.6%、4.1%和17.8%。20株不产ESBLs的敏感大肠埃希菌属于种系发育群A、B1、B2和D类的菌株比例分别为30%、65%、0%和5%。其中在产CTX-M受试菌中,有21.9%菌株具有致病力,而不产ESBLs的敏感菌中仅有5%具有致病力,且高致病力菌株仅出现在产CTX-M菌中,说明产CTX-M鸡大肠埃希菌的致病力可能较不产酶的细菌强,但尚须进一步试验证实。MLST结果显示,73株产blaCTX-M大肠埃希菌中共检出26个ST型,20株不产ESBLs菌株共检出10个ST型,其中ST155和ST359在blaCTX-M菌株和不产ESBLs中均有检出,且ST155在两类细菌中的检出率均最高。本批受试菌中共检出10个新发现的ST型,其中ST4753中的fumC612和ST4752中的mdh382为发现的新的等位基因,相关序列均已提交至MLST数据库。不仅说明本批受试菌的亲缘关系复杂,分属于不同的克隆株,且变异速度快,也说明克隆在CTX-M的散播中仅发挥了次要的作用。综上所述,目前河南省产CTX-M鸡大肠埃希菌中流行的基因亚型以CTX-M-1亚群和CTX-M-9亚群为主,有少量的杂合基因检出,CTX-M基因亚型日趋复杂多样。产CTX-M菌株的亲缘关系复杂,来源也呈现多样化;ISEcp1插入序列和接合性质粒在blaCTX-M基因散播过程中发挥了至关重要的作用,而克隆仅发挥了次要的作用。