小肠在维持正常生命活动中执行消化、营养吸收、代谢稳态、微生物机械屏障、粘膜免疫等功能。肠道上皮由单层柱状上皮细胞构成的隐窝-绒毛结构单元构成,通过快速更新维持肠道稳态。肠道干细胞（Intestinal stem cells,ISCs）是一类负责肠道上皮自我更新的成体干细胞,位于肠粘膜隐窝底部,以特征性非对称分裂的方式完成自我更新并分化形成不同细胞类型。肠道干细胞在肠道发育、稳态维持和损伤修复中起重要作用。隐窝基底柱状细胞（Crypt base columnar cell,CBC）是最常见的ISCs,其干细胞标记物为Lgr5。肠道干细胞一方面自我更新产生新的干细胞,另一方面分化成快速增殖的短暂扩增细胞（Transit amplifying cell,TA cell）。TA细胞逐渐向绒毛顶端迁移分化成吸收型/分泌型两种类型祖细胞并最终形成终末分化细胞,包括潘氏细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、Tuft细胞、肠上皮细胞和M细胞等。多种信号通路在调控ISCs自我更新及分化中具有重要作用,共同决定其细胞命运。Wnt信号通路对于ISCs的功能维持与更新是必不可少的。小鼠肠道敲除Wnt通路Tcf4基因或过表达Wnt拮抗基因Dickkopf1（DKK1）会导致ISCs显著减少。除Wnt通路外,ISCs干性的维持也依赖于激活的Notch信号通路。ISCs分化过程中,Wnt信号通路激活同时Notch信号通路关闭会导致ISCs向潘氏细胞（Paneth cells,PCs）分化。Notch信号通路激活同时Wnt信号通路关闭会促进ISCs向吸收细胞分化。相反,BMP信号通路激活会抑制肠道干性维持。BMP受体BMPR1A的条件敲除小鼠或者BMP抑制因子Noggin过表达的转基因小鼠出现异位隐窝形成增多。多个信号通路构成复杂的细胞干性和命运决定调控网络,发现新的调控因子并明确其调控的具体分子机制,将为肠道发育和稳态维持研究提供新的理论基础,并对发现疾病治疗的靶点具有重要意义。CUL4B基因编码的蛋白属于Cullin家族,该家族成员参与构成的CULLIN-RING（CRL）泛素连接酶家族,是已知哺乳动物最大的一类E3泛素连接酶。CRL4B复合物参与调节细胞周期、转录、信号转导、生长发育、病毒感染以及DNA损伤修复等多种生命活动。CUL4B作为CRL4B复合物的支架蛋白,通过N末端与DDB1蛋白和衔接蛋白相连,C末端与RING蛋白结合,介导泛素分子从E2酶向底物蛋白的转移完成泛素化。CUL4B与CUL4A高度同源,因含有核定位信号,CUL4B主要定位于细胞核,而CUL4A主要定位于细胞质。课题组前期研究发现Cul4b全身性敲除小鼠早期发育异常导致胚胎致死。研究表明Cul4b敲除小鼠附睾中成熟精子数目减少且形态异常,胰岛delta细胞中特异性敲除Cul4b导致胰岛素分泌降低进而引起葡萄糖不耐受,这些结果提示CUL4B在发育中的作用不可替代。CUL4B参与多个信号通路调控。肝癌中CUL4B通过核依赖的转录抑制作用保护β-catenin免受GSK3介导的蛋白降解而促进Wnt/β-catenin通路;CRL4B复合物通过泛素化降解PPARy影响脂肪细胞分化,导致敲除小鼠更倾向于肥胖。然而,CUL4B在肠道调控中的作用目前一无所知。因此,本课题将采用基因敲除小鼠结合肠道类器官模型,对CUL4B在肠道中的表达特征、调控功能和ISCs干性命运决定中的作用进行探讨并分析具体的分子机制。第一部分 CUL4B在肠道稳态维持中的作用本部分我们成功建立Cul4b肠道敲除小鼠模型,初步分析CUL4B在肠道发育及自我更新中的作用,取得以下结果:1.CUL4B高表达于肠道隐窝干细胞区。通过小肠组织和类器官进行免疫荧光染色和Western Blot检测发现CUL4B在小肠所有肠段均表达,高表达于隐窝底部的干细胞区域的细胞质中。免疫荧光共染证实CUL4B与ISCs标记物Lgr5及潘氏细胞标记物Lyz共表达。CUL4B在干细胞富集的扩增培养基的类器官中显著高表达。2.Cul4b敲除小鼠小肠自我更新减慢。我们构建了 Cul4b基因肠道上皮特异性敲除小鼠pVillin-Cre（KOIEC）、可诱导型Cul4b敲除小鼠C4G-CreERT2（KOCAG）和肠道干细胞特异的可诱导型敲除Cul4b小鼠Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2（KOLgr5）。与WT小鼠相比,KOIEC小鼠的体重不变,各肠段肠重减轻。H＆E染色证实Cul4b肠道敲除小鼠绒毛和隐窝长度缩短,CUL4B过表达小鼠绒毛和隐窝长度增加。BrdU掺入实验和Lgr5+荧光示踪实验证实Cul4b肠道敲除小鼠小肠自我更新速度减慢。我们对Cul4b肠道敲除及对照小鼠RNA-Seq测序的GO、KEGG及GSEA分析发现CUL4B缺失组织和类器官中核糖体代谢和DNA复制相关通路下调。对增殖细胞标记物PCNA免疫荧光染色证实增殖细胞数目在敲除Cul4b后显著下降。3.CUL4B缺失影响ISCs数目及分化细胞类型。通过对肠道干细胞以及分化细胞标记物的免疫荧光/免疫组化染色、原位杂交、实时定量PCR检测分析,证实Cul4b缺失导致ISCs和分泌型祖细胞分化的潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞数目减少,而吸收型肠上皮细胞数目增多。RNA-Seq测序也表明CUL4B缺失导致PPAR信号通路等吸收功能增强。8周和18周龄小鼠CUL4B影响肠道表型没有明显差异。4.类器官验证CUL4B在肠道调控中的作用。我们分离KOIEC小鼠和同窝对照WT小鼠隐窝,分别在增殖培养基和分化培养基中培养,发现敲除Cul4b导致类器官生长减慢、出芽率明显降低。对KOIEC及对照WT小鼠类器官克隆形成率进行分析,发现敲除Cul4b的类器官克隆形成能力明显降低。增殖标记物Ki67的免疫荧光染色证实,KOIEC类器官增殖速度减慢。进一步,我们在类器官中检测潘氏细胞数目,通过Lyz和UEA-1免疫荧光染色证实与小肠组织一致,KOIEC类器官每个芽体中含潘氏细胞平均数量显著减少。在CUL4B转基因小鼠的类器官中潘氏细胞数量增加。综上所述,我们发现CUL4B在肠道隐窝干细胞区以肠道组织特异的方式在细胞质中高表达,我们运用敲除Cul4b小鼠模型和类器官模型发现CUL4B缺失影响肠道发育和自我更新,证实CUL4B在肠道调控中具有重要功能。第二部分 CUL4B促进Wnt/β-catenin信号通路、小肠干细胞自我更新和命运决定第一部分的研究结果显示CUL4B缺失导致小肠自我更新速度减慢,肠道干细胞、和分泌功能细胞减少,而吸收功能的肠上皮细胞数目增多。一方面,Wnt信号对于ISCs的功能维持与更新、分泌型祖细胞形成是必不可少的,另一方面,激活Wnt信号同时关闭Notch信号会促进干祖细胞向潘氏细胞分化,Notch信号开启同时关闭Wnt信号促使干细胞向吸收细胞分化。本部分结合RNA-Seq测序数据,综合分析CUL4B影响的具体通路并运用生化、分子生物学方法进行验证,取得以下结果:1.CUL4B促进肠道Wnt/β-catenin通路表达。在RNA-Seq测序中,我们发现敲除Cul4b小鼠组织和类器官RNA-Seq测序共同变化的差异表达基因与敲除Ctnnb1小鼠以及敲除Apc小鼠组织中的差异表达基因有许多基因重合。实时定量PCR检测进一步验证CUL4B缺失导致Wnt通路下游靶基因显著下调。Western Blot方法检测发现敲除Cul4b后β-catenin、p-GSK3β（Ser9）、Non-p-β-catenin（S33/S37/T41）显著下调。相反的,在CUL4B转基因小鼠中这些蛋白显著上调。2.改变Wnt通路可以拯救敲除Cul4b和过表达导致的小鼠肠道表型。我们在敲除Cul4b类器官模型用GSK3抑制剂CHIR99021和BIO处理细胞,发现Wnt激活剂以剂量依赖的方式拯救CUL4B缺失导致的类器官增殖能力减慢、出芽减少和干性基因、Wnt调控基因的表达降低。相反的,我们用Wnt的抑制剂IWP-2处理CUL4B过表达类器官模型,可以抑制类器官增殖和出芽能力的增多和Wnt靶基因表达的上调。3.潘氏细胞分泌的Wnt信号对CUL4B参与肠道维持是必需的。我们通过收集KOIEC和WT类器官培养基上清,发现CUL4B缺失通过分泌因素影响类器官干性、增殖和部分Wnt调控基因表达。在培养基中加入潘氏细胞分泌的Wnt3a重组蛋白能够拯救CUL4B缺失导致类器官生长速度减慢及β-catenin表达下调。用KOIEC和WT类器官培养基上清处理荧光素报告细胞系HEK293STF和双荧光报告基因细胞TOP/FOP Flash,检测细胞荧光素酶,发现KOIEC类器官分泌更多Wnt激活因子增强Wnt活性。诱导敲除类器官Lgr5+细胞中的CUL4B,短期观察发现与WT类器官相比,分化培养基中KOLgr5类器官出芽率、每个芽体的潘氏细胞数量没有显著性差异。干细胞富集培养基中KOLgr5类器官大小显著减少,但类器官单细胞克隆形成率没有显著性差异。综上所述,本部分我们发现CUL4B促进Wnt/β-catenin通路促进肠道干细胞自我更新和微环境（niche）调控,改变Wnt通路可以拯救敲除Cul4b或过表达引起的肠道表型。潘氏细胞分泌的Wnt3a对CUL4B行使肠道功能是必需的。第三部分CUL4B通过降解IRGM1影响Wnt信号和肠道功能我们的结果证实CUL4B主要表达在肠道细胞质中。为了寻找CUL4B通过26S蛋白酶体途径泛素化降解的底物。我们首先通过非标定量蛋白质组学及泛素化修饰非标定量组学,鉴定出IRGM1是CRL4B复合物的特异性底物,随后我们探究CUL4B如何通过IRGM1参与肠道功能调控,明确是否影响了 Wnt信号通路,本部分取得了以下结果:1.IRGM1是CRL4B复合物的泛素化降解底物。我们对肠道敲除Cul4b和WT小鼠小肠隐窝组织进行非标定量蛋白组学和泛素化修饰非标定量蛋白组学分析。通过综合分析筛选出12个KOIEC小鼠中蛋白水平显著上调、泛素化水平显著下调的候选蛋白,进一步验证发现只有IRGM1蛋白显著累积。2.CUL4B通过降解IRGM1影响潘氏细胞数目和功能。我们在KOIEC类器官中感染shIrgm1的慢病毒,验证发现低表达Irgm1能够拯救由CUL4B缺失引起的肠道类器官的生长变慢和潘氏细胞的数目减少和功能降低。3.CUL4B通过降解IRGM1促进Wnt通路、干细胞自我更新和增殖。在KOIEC类器官中以不同病毒浓度感染干扰Irgm1,发现低表达Irgm1以病毒剂量依赖的形式显著上调敲除Cul4b后下调的Wnt通路靶基因Lgr5和Sox9,并促进Wnt分泌活性。干扰Irgm1能够拯救由于敲除Cul4b导致Wnt/β-catenin通路靶基因mRNA下调,并且部分拯救由于 CUL4B 缺失所引起的 Wnt/β-catenin 相关蛋白 β-catenin、p-GSK3β（Ser9）、Non-p-β-catenin（S33/S37/T41）的下调。干扰Irgm1能够拯救CUL4B缺失引起类器官增殖减慢。4.CUL4B对肠道微生物调控、病原微生物应激作用的初步探究。通过小鼠粪便样本16S RNA测序发现CUL4B不影响粪便菌群多样性。通过鼠伤寒沙门氏菌感染构建小鼠急性结肠盲肠炎症,我们发现缺乏CUL4B的小鼠出现更严重的病原微生物诱导的炎症反应。通过构建微生物显微注射类器官模型,发现缺乏免疫细胞的肠道类器官中缺乏CUL4B不影响病原微生物诱导的肠道炎症。本论文通过构建肠道上皮细胞敲除、可诱导的全身敲除和可诱导的肠道干细胞Cul4b特异性敲除的小鼠模型,以及体外类器官模型,发现CUL4B通过降解IRGM1促进Wnt信号通路,维持肠道稳态功能、干细胞自我更新和细胞命运决定。