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研究目标先前的研究证明选择性阿尔茨海默病指示因子1(Selective Alzheimer’s disease indicator-1, seladin-1)是一个重要的神经保护因子。因此,在中枢神经系统中Seladin-1可能是雄激素的的一个下游目标基因。然而,Seladin-1在雄激素神经保护作用中的意义及其分子调节机制目前仍然没有完全明了。在本研究中,我们首先通过观察雄激素对Aβ25-35诱发的C6细胞增殖活性变化及细胞凋亡活动的影响,同时观察在雄激素保护作用中雄激素对C6细胞seladin-1表达的影响。此外,在雄激素激素对seladin-1表达的调节机制研究中,我们将进一步探讨经典的基因信号通路、PI3-K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路、MAPK/ERK/CREB信号通路对seladin-1表达的影响及其潜在的分子作用机制,进一步阐明雄激素神经保护作用的机制。研究方法在本研究中,我们利用体外培养的C6胶质瘤细胞(C6细胞)株作为体外胶质细胞研究模型,通过观察雄激素对Aβ25-35诱导的C6细胞增殖活性抑制(采用MTT法)与细胞凋亡活动的潜在保护作用(采用Hoechst-PI双标记染色法),初步观察雄激素对C6胶质细胞的神经保护作用。此外,我们还利用免疫印迹检测(Western blot)技术和实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR)技术,进一步评价雄激素保护作用与Seladin-1表达之间的关系及其分子调节机制。研究结果第一部分在本部分研究中,我们发现,Aβ2H5对C6细胞具有明显的细胞增殖活性抑制效应,而雄激素具有非常显著抑制Aβ25-35诱发的细胞增殖活性下降作用。同时,我们在荧光显微镜下观察也发现,Aβ25-35对C6细胞具有明显的凋亡诱导作用,而雄激素可以明显拮抗其诱发的凋亡活动。上述结果提示,雄激素对Aβ25-35诱发的C6细胞凋亡具有明显的神经保护作用。我们进一步观察发现,雄激素处理后的C6细胞Seladin-1表达显著增加,而Aβ25-35单独处理组C6细胞Seladin-1表达轻度下降。睾丸酮诱导的凋亡保护蛋白Seladin-1表达上调效应能够被雄激素受体阻断剂氟他胺所显著抑制。上述结果进一步证明,雄激素可能通过上调Seladin-1蛋白而产生抗凋亡保护效应。第二部分在本部分研究中,我们发现,在Seladin-1的蛋白质合成和基因转录水平上所有浓度的睾丸酮(实验用)均可以显著增加C6胶质细胞的Seladin-1表达水平。而选择性的雄激素受体(AR)阻断剂氟他胺(Flutamide)可以呈现明显的浓度依赖性地阻断雄激素诱导的C6细胞Seladin-1的上调表达。上述资料提示,Seladin-1是雄激素的下游目标基因之一,睾丸酮通过经典受体基因信号通路介导了Seladin-1基因的表达。第三部分进一步研究发现,在C6细胞上睾丸酮可以明显提高V-akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因(V-akt murine thymoma viral oncogene, AKT)激酶(AKT激酶)的磷酸化激活水平。AKT激酶作为细胞磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol-3kinase,P13-K)／Akt信号转导通路(即P13-K/Akt信号通路)激活的关键性效应因子,是PI3-K/AKT信号通路激活的主要标志之一。但是,睾丸酮诱导的AKT激酶的磷酸化激活可以明显被特异性、选择性的P13-K抑制剂LY294002所抑制。上述结果支持,在C6细胞上睾丸酮可以直接激活C6细胞的PI3-K/Akt信号通路。此外,我们也发现睾丸酮可以明显促进PI3-K/AKT信号通路下游的关键信号蛋白分子糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase3beta, GSK-3β)磷酸化修饰活动,而GSK3β的下游作用底物,即辅助转录因子β-连锁蛋白(Beta-catenin, β-catenin)表达也受睾丸酮诱导后明显升高。但是,而P13-K抑制剂LY294002可以明显阻断睾丸酮诱导的下游信号分子GSK3β磷酸化作用,而选择性P13-K抑制剂LY294002也明显阻断了睾丸酮诱发的下游β-catenin表达升高。上述资料提示,睾丸酮通过上游P13-K/Akt通路进一步激活了下游的GSK3β/β-catenin信号通路。综合上述的结果提示,在C6细胞上睾丸酮可以直接激活C6细胞的PI3-K/AKT/GSK3β/β-catenin细胞信号转导通路。我们也发现,在P13-K/Akt信号通路的上游信号通路上,不同浓度的选择性P13-K抑制剂LY2940023可以在蛋白质合成和基因转录水平上呈现明显抑制睾丸酮诱发的seladin-1基因的上调表达作用。同时,在PI3-K/Akt通路的下游GSK3β/β-catenin信号通路上,我们发现选择性GSK3β抑制剂SB216763可以明显阻断GSK3β功能活性而诱导β-catenin蛋白表达升高。而通过诱导β-catenin蛋白聚集升高,SB216763也明显激活了Seladin-1基因的表达。所以,综合上述的结果,我们的资料支持睾丸酮部分通过PI3-K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路上调seladin-1基因的表达。第四部分在丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)(MAPK/ERK)信号通路作用的研究中我们发现,不同浓度的睾丸酮(实验选择)均可以快速、显著地促进ERK1、ERK2的磷酸化水平升高,睾丸酮对ERK1、ERK2激活效应在24小时左右恢复到基线水平。ERK1、ERK2磷酸化激活也是MAPK/ERK细胞信号通路激活的主要标志之一,而ERK1、ERK2也在MAPK/ERK细胞信号通路中发挥着关键性作用。上述资料提示,在睾丸酮效应中MAPK/ERK信号通路可能在早期起到短暂、快速的效应作用。此外,我们也观察了睾丸酮对MAPK/ERK信号通路下游的关键信号分子——cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)磷酸化活动的激活作用。我们发现不同浓度的睾丸酮均可以明显促进下游信号分子CREB的磷酸化活动,从而激活了MAPK/ERK信号通路下游的CREB信号通路。而选择性的MEK抑制剂U0126可以从MAPK/ERK信号通路的上游明显阻断睾丸酮诱导的CREB磷酸化激活效应。因此,上述实验结果提示睾丸酮可以激活C6细胞的MAPK/ERK/CREB细胞信号转导通路。进一步观察发现,作为MAPK/ERK细胞信号通路的上游阻断剂——选择性的MEK抑制剂U0126,U0126可以明显的以浓度依赖性方式在蛋白质合成和基因转录水平上阻断睾丸酮诱导的seladin-1的上调表达。因此,我们的实验结果支持,睾丸酮也可以通过激活C6细胞的MAPK/ERK/CREB信号通路调节seladin-1基因的表达。研究结论综上所述,我们可以认为,雄激素具有明显地抗Aβ25-35诱发C6细胞凋亡损害活动的神经保护作用。雄激素可能通过上调Seladin-1基因表达而产生抗凋亡神经保护效应。Seladin-1基因是雄激素的一个重要的下游目标基因。雄激素通过激活经典的受体基因信号通路、PI3-K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路、MAPK/ERK/CREB信号通路上调seladin-1基因的表达,从而产生抗凋亡保护作用。