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目的: 本课题用β2-GPⅠ作为免疫原,建立ACA阳性先兆流产模型小鼠,通过观察安子合剂对ACA阳性先兆流产小鼠母胎界面胎盘及蜕膜ERK信号转导途径的影响以及调控mmp2、mmp9蛋白的表达,从细胞增殖的角度探讨安子合剂治疗ACA阳性先兆流产的病理机制,为进一步研究打下良好的实验基础,提供更新的理论依据。 方法: 1.将BALB/C小鼠随机分为6组:模型组、空白对照组、安子合剂低/中/高剂量组和阿司匹林组。人β2-GPⅠ溶于无菌PBS中,调整浓度为100ug/0.25ml,模型组、安子合剂低/中/高剂量组、阿司匹林组第1天腹腔注射人β2GP-1溶液与CFA1∶1比例混合液50ul,空白对照组注射生理盐水50ul;第8天以IFA代替CFA加强免疫1次;第18天各组雌性小鼠与雄性小鼠1∶1合笼,以见到阴栓为妊娠第0天。在妊娠第15天时摘眼球取血,离心取上清,子宫、胎盘、胎鼠分别进行称重,观察胚胎丢失情况,计算胚胎丢失率,采用ELISA方法检测外周血ACA、抗β2-GPⅠ抗体浓度。 2.动物解剖后,取胎盘、子宫组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋用于常规组织病理切片。采用HE染色和二步法免疫组化检测,观察模型组、空白对照组、安子合剂低/中/高剂量组和阿司匹林组蜕膜、胎盘组织病理变化,各组ERK1/2、MEK1/2、Raf1、C-Fos磷酸化定位在小鼠子宫蜕膜和绒毛组织细胞胞浆中,根据JD801形态学统计分析各组ERK1/2、MEK1/2、C-Fos、Raf1平均光密度值。 3.动物解剖后,取胎盘、子宫组织,各个组别进行蛋白提取,测定各组蛋白浓度,采用Westen blot方法,实验步骤包括SDS-PAG的制备、样本准备和上样电泳、湿电转移、封闭、抗体与靶蛋白结合、显影和图像分析,分别检测mmp2、mmp9在模型组、空白对照组、安子合剂低/中/高剂量组和阿司匹林组胎盘与蜕膜中蛋白水平的表达。 结果: 1.以β2-GPⅠ为免疫原,成功复制ACA阳性流产模型。 2.模型组动物的胚胎丢失率较空白对照组显著升高(P<0.01);安子合剂低剂量组能显著降低模型动物胚胎吸收率,显著增加模型动物胎鼠、胎盘重量(P<0.05)。安子合剂高剂量组、阿司匹林组胚胎吸收率、胎盘胎鼠重量与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。 3.模型组动物的ERK1/2、MEK1/2、C-Fos、Raf1平均光密度值较空白对照组显著下降(P<0.01);与模型组相比,安子合剂低剂量组、中剂量组、阿司匹林组均能显著升高ERK1/2、MEK1/2、C-Fos、Raf1平均光密度值(P<0.01),其中安子合剂低剂量组疗效优于中剂量组和阿司匹林组(P<0.01)。安子合剂高剂量组ERK1/2、MEK1/2、C-Fos、Raf1平均光密度值与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。 4.模型组小鼠胎盘中mmp2蛋白表达较对照组明显降低;与模型组相比,安子合剂低剂量组、中剂量组、阿司匹林组均能显著升高mmp2的蛋白表达,其中安子合剂低剂量组疗效优于中剂量组和阿司匹林组。模型组小鼠胎盘中mmp9蛋白较对照组明显降低;与模型组相比,安子合剂低剂量组mmp9的蛋白表达升高。 5.模型组小鼠蜕膜中mmp2蛋白表达较对照组明显升高;与模型组相比,安子合剂低剂量组mmp2的蛋白表达降低。 6.与模型组相比,安子合剂低、中剂量组能显著降低模型动物外周血ACA滴度(P<0.01),安子合剂低剂量组疗效优于中剂量组(P<0.01)。安子合剂高剂量组、阿司匹林组外周血ACA滴度与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。 7.与模型组相比,安子合剂低、中剂量组能显著降低模型动物外周血抗β2-GPⅠ抗体浓度(P<0.01),安子合剂低剂量组疗效优于中剂量组(P<0.01)。安子合剂高剂量组、阿司匹林组外周血抗β2-GPⅠ抗体浓度与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。 结论: 在以β2-GPⅠ为免疫原,成功复制ACA阳性流产模型的基础上,通过实验研究得出以下结论:①ACA阳性流产的病理机制之一是由于ERK1/2活性的降低,抑制滋养层细胞的增殖,导致胎盘功能减退,血流灌注不行,引发血栓,胚胎着床后出现早期死亡;安子合剂可以通过ERK信号转导通路提高细胞增殖的活性,改善胎盘功能,改变妊娠结局。②安子合剂能够调节滋养层细胞的增殖与mmp2、mmp9蛋白的表达之间的平衡;ACA阳性先兆流产血栓形成的病理机制之一是由ACA通过ERK信号通路途径调控mmp9表达所致,提示安子合剂可以通过调控血管内皮细胞mmp9的表达干预ACA诱导的血栓形成。③安子合剂作用的强弱与药物的剂量密切相关,实验研究表明安子合剂低剂量组具有临床等效性,接近于空白对照组,优于中剂量组和阿司匹林组;随着剂量的增加,反而引起代谢障碍而使得效果逐渐减弱,因此安子合剂高剂量组无明显疗效。