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妊娠期和哺乳期是个体发育的“窗口期”,该阶段母体营养水平通过DNA甲基化等表观修饰对子代的生长发育和代谢性能起着至关重要的作用。甜菜碱（Betaine）是含有三个活性甲基基团的高效甲基供体,作为蛋氨酸循环的底物参与一碳代谢,为机体大部分甲基化反应提供甲基基团。前期我们发现妊娠期日粮中添加甜菜碱能够显著提高新生仔猪肝脏胆固醇含量及减少甘油三酯含量,并且伴随着DNA甲基化及组蛋白甲基化的变化;然而母体添加甜菜碱对子代断奶阶段的脂代谢影响尚不清楚。此外,营养过剩和长期应激均会导致脂肪在肝脏内过度沉积进而诱发非酒精性脂肪肝疾病;模式动物研究发现日粮中添加甜菜碱能够缓解高脂高糖诱导的非酒精性脂肪肝。然而,母源性甜菜碱对子代大鼠糖皮质激素应激诱导的肝脏内脂质沉积的作用尚不知晓,以及脂肪组织在非酒精性脂肪肝发生中扮演的角色有待进一步研究。最后,在体外细胞模型上探索甜菜碱缓解脂质沉积的作用机制。1 母源性甜菜碱对断奶仔鼠肝脏脂质代谢的影响及其机制为了探索母源性添加甜菜碱对断奶仔鼠肝脏脂质代谢的影响,我们采用3月龄雌。性SD大鼠,确认怀孕后将母鼠随机分为对照组和试验组,在妊娠期和泌乳期分别饲喂基础日粮和添加1%甜菜碱的基础日粮直至断奶。结果发现,与对照组相比,甜菜碱组断奶仔鼠体重有降低趋势（P=0.085）,而肝脏重和肝脏/体重比值没有显著差异。母鼠妊娠期和泌乳期添加甜菜碱显著升高了断奶仔鼠血液中总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的含量（P<0.05）,对葡萄糖、甘油三酯及低密度脂蛋白胆固醇没有影响。此外,与对照组相比,甜菜碱组肝脏内胆固醇含量显著升高（P<0.05）,而甘油三酯含量没有显著变化。Real-time RCR结果显示,母鼠妊娠期和泌乳期添加甜菜碱显著降低了断奶仔鼠肝脏中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase,HMGCR）和胆固醇 7α-羟化酶（Cholesterol 7 alpha-hydroxylase,CYP7A1）mRNA 的表达（P<0.05）,而固醇调节元件结合蛋白 2（Sterol regulatory element-binding protein 2,SREBP2）、胆固醇 27α-羟化酶（Cholesterol 27 alpha-hydroxylase,CYP27A1）和低密度脂蛋白受体（Low-Density Lipoprotein Receptor,LDLR）的mRN A表达没有显著差异。Western blot结果显示,甜菜碱组断奶仔鼠肝脏CYP7A1蛋白含量显著下降（P<0.05）以及LDLR蛋白含量显著性升高（P<0.05）;然而脂肪酸代谢相关基因的蛋白表达在两组间没有显著变化。此外,甜菜碱组甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（Betaine-homocysteine methyltransferase,BHMT）的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）,而对甘氨酸N-甲基转移酶（Glycine N-methyltransferase,GNMT）、S-腺苷高半胱氨酸水解酶样因子1（S-adenosyl homocysteine hydrolase-like 1,AHCYL1）和 DNA 甲基转移酶 1（DNA methyltransferase 1,DNMT1）的mRNA和蛋白表达均没有显著变化。进一步利用甲基化 DNA 免疫共沉淀（Methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP）分析肝脏中胆固醇相关的基因启动子区DNA甲基化富集水平,结果表明:甜菜碱组肝脏CYP7A1基因启动子区高甲基化（P<0.05）,这与mRNA表达水平呈反向一致。以上结果表明,母鼠日粮添加甜菜碱提高了断奶仔鼠肝脏中胆固醇水平,而不影响甘油三酯的含量。2母源性甜菜碱对地塞米松诱导的子代大鼠肝脏脂质代谢的影响及其机制为了探究母源性甜菜碱对子代大鼠糖皮质激素应激诱导的肝脏脂质代谢的影响。我们对断奶后的对照组和甜菜碱组仔鼠继续饲喂基础日粮,在第90天时,分别腹腔注射生理盐水和0.1mg/kg/d的地塞米松,分成4组（Con-Con,Con-Dex,Bet-Con,Bet-Dex）,3周后处死,采集血清和肝脏样品,液氮速冻后转入-80℃低温冰箱储存。结果发现,注射地塞米松后,显著降低了大鼠体重（P<0.05）,采食量呈下降趋势（P=0.06）,而母体添加甜菜碱没有缓解仔鼠体重和采食量的变化;此外,肝脏重以及肝脏重/体重没有显著差异。与Con-Con组相比,地塞米松注射后显著升高了血清中甘油三酯水平（P<0.05）,并且降低了血清中总胆固醇、高低密度脂蛋白胆固醇的含量（P<0.05）,然而妊娠期和泌乳期日粮添加甜菜碱没有改善地塞米松诱导的变化。HE和油红染色结果显示,妊娠期和泌乳期日粮中添加甜菜碱显著减少了地塞米松诱导的子代大鼠肝脏脂肪空泡及脂滴积聚。生化分析结果进一步表明,母鼠添加甜菜碱能够减少地塞米松诱导的肝脏甘油三酯的增多（P<0.05）。RT-RCR和WB结果显示,母鼠妊娠期和泌乳期日粮中添加甜菜碱能够显著缓解地塞米松诱导的肝脏组织乙酰辅酶 A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACC）、脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase,FAS）及硬脂酰辅酶A去饱和酶（Stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1）的mRNA和蛋白的高表达（P<0.05）。然而,对脂肪甘油三酯脂酶（Adipose triglyceride lipase,ATGL）、过氧化物酶体增殖物激活受体 α（Peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα）、肉毒碱棕榈酰转移酶 1α（Carnitine palmitoyltransferase 1α,CPT1α）、脂肪酸结合蛋白（Fatty acid binding protein,FABP）和脂肪酸转位酶（Fatty acid translocase,FAT/CD36）的表达均没有显著影响。进一步利用MeDIP技术检测脂肪酸合成相关基因启动子甲基化水平。MeDIP结果显示母体添加甜菜碱显著缓解了地塞米松诱导的ACC1和SCD1基因启动子区的低甲基化水平（P<0.05）,这与mRNA表达水平呈反向一致。我们预测到脂肪酸合成基因ACC1、FAS及SCD1上有GR和SP1的结合位点,染色质免疫共沉淀（ChIP）结果表明妊娠期和泌乳期日粮中添加甜菜碱能够显著降低地塞米松诱导后GR或SP1与ACC1、FAS及SCD1启动子的高水平结合（P<0.05）,而且与核内GR和SP1蛋白表达相一致（P<0.05）。以上结果表明,母体日粮添加甜菜碱可能通过DNA甲基化和GR或SP1介导的调节机制缓解地塞米松诱导的非酒精性脂肪肝。3母源性甜菜碱对地塞米松诱导的子代大鼠脂肪组织脂代谢的影响及其机制为了探究脂肪组织在甜菜碱缓解非酒精性脂肪肝中的作用,我们采集了大鼠附睾脂肪。实验发现无论是甜菜碱还是地塞米松处理,大鼠附睾脂重和附睾脂重/体重均没有显著差异。此外,母鼠妊娠期添加甜菜碱可以降低地塞米松诱导的子代大鼠血清中胰岛素、IL6和TNFα水平（P<0.05）,但血清中游离脂肪酸的含量没有受到显著影响。RT-RCR和WB结果显示,母鼠妊娠期和泌乳期日粮中添加甜菜碱能够缓解地塞米松诱导的脂肪组织脂解关键酶脂肪甘油三酯脂酶（Adipose triglyceride lipase,ATGL）和激素敏感脂酶（Hormone sensitive lipase,HSL）的 mRNA 表达（P<0.05）,ATGL蛋白表达和HSL磷酸化蛋白水平也显著得到缓解（P<0.05）。但是乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACC）及脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase,FAS）的蛋白表达均没有发生显著变化。此外,我们还发现,妊娠期和泌乳期添加甜菜碱可以缓解地塞米松诱导的血液中内源性皮质酮水平的减少以及脂肪组织糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor,GR）的高表达（P<0.05）。另一方面,无论是甜菜碱添加还是地塞米松处理,对AMPK及AKT的蛋白水平都没有显著性影响。进一步利用甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）检测脂肪组织ATGL和HSL基因启动子区DNA甲基化水平。结果显示,母体添加甜菜碱显著缓解了地塞米松诱导的ATGL基因低甲基化水平（P<0.05）,这与mRNA表达水平呈反向一致。然而没有缓解地塞米松诱导的HSL基因低甲基化。以上结果表明,妊娠期和哺乳期添加甜菜碱可能通过DNA甲基化调节脂解关键基因的表达,进而改善地塞米松诱导的脂肪组织功能紊乱。4甜菜碱对HepG2细胞脂质沉积的影响及机制为探究GR和DNA甲基化在非酒精性脂肪肝中的作用,我们采用油酸或地塞米松联合油酸的方法刺激HepG2细胞建立体外肝细胞脂质蓄积模型进而分析甜菜碱的作用。采用试剂盒检测TG含量,油红染色观察脂滴聚集情况,并采用WB和MeDIP等技术分析脂代谢相关基因的变化。结果显示,甜菜碱能够显著降低油酸诱导的TG含量的升高,而不能缓解地塞米松联合油酸诱导的脂质沉积。WB结果显示,无论是油酸、甜菜碱还是联合处理均不影响GR、p-GR及p-GR/GR的蛋白表达,而地塞米松联合油酸处理后甜菜碱不能改变p-GR/GR 比值的升高。MeDIP结果表明甜菜碱用药后能够逆转油酸诱导的ACC 1、FAS和PPARγ基因的低甲基化（P<0.05）。细胞内TG结果显示,采用GR抑制剂RU486处理后,甜菜碱能够逆转地塞米松联合油酸诱导的脂质沉积;此外,甲基化抑制剂5AZA能够抑制甜菜碱缓解TG作用。以上结果表明,甜菜碱能够通过DNA甲基化缓解油酸诱导的非酒精性脂肪肝。综上所述,妊娠期和泌乳期日粮中添加甜菜碱能够提高断奶仔鼠肝脏胆固醇含量,而不影响甘油三酯的水平。成年期地塞米松注射后,甜菜碱可以通过调控肝脏和脂肪的脂质代谢,从而缓解非酒精性脂肪肝。这可能是由于甜菜碱改变了机体DNA甲基化修饰进而影响脂质代谢。