研究背景及目的国内外流行病学调查结果显示急性心肌梗死的发病率与死亡率逐年上升。随着治疗手段的不断发展,心梗后患者的寿命逐渐延长,但目前急性心肌梗塞仍是全球心衰发生的最重要病因之一。中国心梗后心衰的发病率高、预后差,且呈现上升趋势。心梗后发生心衰增加患者的短期及长期的不良事件风险。心梗后心衰发生的病理生理基础是心脏结构重构和能量重构。心脏正常的能量代谢是保障心脏内环境稳定性,促进组织结构维持正常机能的重要因素。心脏能量代谢形成的产物主要是三磷酸腺苷（ATP）,ATP是心肌供能的基本物质。心梗后随着心肌结构重构的进展,心肌细胞自身的代谢过程也在持续变化,在心肌能量代谢的过程中一旦发生代谢紊乱,也影响心肌自身的结构重构。线粒体是真核细胞能量形成的关键场所,以氧化磷酸化作为基础,产生ATP等高能磷酸物。改善缺血心肌细胞线粒体功能,促进良性代谢重构,是目前防治心梗后心衰研究的方向之一。线粒体自噬与心肌能量代谢关系密切。线粒体自噬在进行的过程中,可以直接清除线粒体本身的结构与功能异常,调节线粒体的数量和质量,确保线粒体自身功能的有效性,是维持细胞能量代谢正常和平衡的重要因素之一。研究显示线粒体自噬在心梗后心室重构、心衰发展中有重要作用。研究表明心梗后心肌细胞内线粒体自噬适量的增加,能够直接清除身体内部的机体衰老或者存在异常的线粒体,降低内源性活性氧（ROS）的水平,为正常功能的线粒体合成能量提供物质,保证心肌的正常ATP的水平,满足心肌需要;心梗后心肌细胞早期（1～3d至1w内）自噬水平显著增加,以支持心肌细胞的存活,伴随着缺血时间的逐渐加长,线粒体自身的受损、氧化应激反应增强,自噬水平失衡,心肌细胞坏死增加,加重心梗后心衰的进展。自噬通过介导心肌细胞凋亡恶化心室重构,同时也影响正常线粒体的功能,导致能量代谢的异常,进一步加重心脏受损。线粒体自噬参与心梗后心衰的发生、心室重构、能量代谢等多方面,是目前探索心衰治疗的潜在靶点。近年来研究显示ATP敏感钾通道（KATP）在线粒体自噬过程中发挥巨大的作用。线粒体内部的KATP通道打开,利用这种方式针对线粒体内部的膜电位进行调节,降低线粒体中的Ca2+超载情况,同时直接影响ROS生成,完善线粒体本身的呼吸链,抑制细胞凋亡,促进线粒体自噬的发生。有研究发现心梗后心衰大鼠缺血心肌细胞内KATP通道与组织中的血管紧张素（Ang Ⅱ）呈正相关。梗死后心肌组织中Ang Ⅱ的浓度升高,Ang Ⅱ通过TNF-α作用于转录因子FOXO3增加KATP的表达。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂通过阻断Ang Ⅱ与AT1结合发挥改善心梗后心衰、抑制心室重构。因此,我们提出假说,ARB类药物氯沙坦可能通过KATP通道抑制线粒体自噬改善心脏功能和心肌能量代谢。本研究通过建立心肌梗死心衰模型,观察氯沙坦对心梗后心衰大鼠心脏功能、线粒体功能、线粒体自噬水平的影响。同时,采用Ang Ⅱ诱导H9C2心肌细胞损伤模型,利用开放剂和阻断剂调节线粒体KATP通道,探索氯沙坦调节线粒体自噬的分子机制。方法1.构建心梗后的心衰模型:针对大鼠自身的冠状动脉进行结扎,利用这种方式诱导后续的心梗后心衰,术后第二天行超声心动图检测,左室射血分数（LVEF）＜50%作为模型成功的标准。针对实验大鼠进行随机分析分析,共计三组:假手术组（sham组,n=15）,心衰组（HF组,n=15）,氯沙坦治疗组（HF+ARB,n=15,10mg/kg/d）。干预4周以后,行大鼠血流动力学、超声心动图与心电图、病理学染色以及分子生物学指标检测心梗后缺血区心肌细胞线粒体自噬的程度,以及KATP通道的表达水平。2.以Ang Ⅱ针对H9C2心肌细胞进行诱导,同时基于此构建损伤模型。针对细胞进行随机分组分析,其中主要涵盖了对照组（Control）与模型组（Ang Ⅱ）、二氮嗪组（Ang Ⅱ+Diazoxide,特异性mitoKAPT通道开放剂）、5-羟奎酮（AngⅡ+5-HD,mitKATP特异性阻断剂）、氯沙坦组（Ang Ⅱ+ARB）。Western blot 测定筛选出诱导H9C2心肌细胞发生自噬水平最高的Ang Ⅱ浓度和作用时间。利用流式细胞仪针对细胞自身的凋亡率展开测量,测定活性氧自由基（ROS）、NADPH氧化酶活性评估氧化应激水平,同时利用这种方式针对Atg5、Beclin-1与LC3BⅡ/Ⅰ对应的蛋白表达水平进行测量。结果1.动物实验（1）心脏超声:从结果进行分析,将其和Sham组之间进行对比分析,从HF组大鼠的情况来看,其左室射血分数,左室短轴缩短率等明显降低（P＜0.05）,而左室舒张末内径显著增加（P＜0.05）。与HF组相比,氯沙坦干预组（HF+ARB组）的LVEF,LVFS明显增加,LVIDd显著降低（P＜0.05）。（2）血流动力学:与Sham组相比,针对HF组大鼠进行分析,其左室压力最高增加速率（+dp/dtmax）左室收缩末压力（LVEPs）等参数都出现了明显下降的情况,同时从其左室舒张末压力（LVEPd）数据来看,出现了显著的增高（P＜0.05）。氯沙坦治疗后LVEPs,+dp/dtmax与-dp/dtmax和HF组相比显著增加,LVEPd出现了明显降低（均P＜0.05）。（3）心电图:Sham组大鼠在术后监测过程中无心律失常发生。而HF组大鼠心律失常的发生率为65.23%,HF+ARB组发生率为33.86%。与Sham组相比,HF组大鼠心室率显著增快（P＜0.05）,氯沙坦能均能显著降低心室率（P＜0.05）。HF组PR间期和QTc间期显著延长（P＜0.05）,氯沙坦缩短大鼠的QTc延长（P＜0.05）。（4）HE染色:针对Sham组大鼠进行分析,其心肌组织整体结构保持正常。心肌细胞分布规矩,同时横纹清晰,胞核居中。HF组心肌组织内可见左室透壁性坏死的心肌和纤维组织,在心肌瘢痕组织边缘区的缺血区内能够明显的看出心肌细胞存在排列不规律的情况,同时其中的心肌细胞出现了代偿性肥大问题,心肌细胞的整体排列不规律,横纹不规整。HF+ARB组大鼠的左室的梗死区明显缩小,心肌的组织结构基本完整,同时肌纤维排列基本整齐。（5）MASSON染色:与Sham组相比,HF组大鼠左室心肌梗死区可见大量的瘢痕胶原组织,而缺血区心肌细胞的结构排列紊乱,其中有大量胶原蓄积,且心肌内胶原纤维交错分布。HF+ARB组缺血区心肌组织内纤维化程度较心衰组大鼠减轻,多在心肌组织内包裹性分布。（6）电镜:针对Sham组大鼠进行分析,其心肌细胞内部的线粒体结构比较清晰,同时分布规律、数量密集。线粒体内的闰盘清晰可见,界嵴排列规整、清楚密有序。HF组大鼠心肌细胞缺血区心肌细胞的线粒体明显肿胀、闰盘扩张模糊、代偿性增生,自噬体增加。HF+ARB组大鼠心肌细胞内线粒体密度较HF组合HF+ARB增加,线粒体的肿胀减轻,闰盘结构清晰。（7）ATP浓度:与Sham组相比,HF组的ATP含量明显下降（P＜0.05）;与HF组相比,ARB治疗后梗死周围的缺血心肌细胞的ATP浓度明显增加（P＜0.05）。（8）KATp通道蛋白:与Sham组相比,HF组大鼠心肌组织中的KATP通道蛋白Kir6.2、SUR2A、MITOK和MITOSUR均代偿性的轻度升高（均P＜0.05）。与HF相比,氯沙坦降低心肌细胞中MITOK和MITOSUR的表达（均P＜0.05）,但对Kir6.2和SUR2A的表达无明显作用。（9）线粒体自噬蛋白:和Sham组进行对比,从HF组大鼠的情况来看,其中的心肌细胞内部P62出现了表达下降的情况,Beclin-1与LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ上升（均P＜0.05）。和HF组进行对比分析,HF+ARB组心肌细胞中P62的表达增加,Beclin-1 和 LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ 的表达降低。2.细胞实验（1）筛选氯沙坦干预治疗的药物浓度:CCK8测定ARB在不同浓度和不同时间对H9C2心肌细胞活力的影响。结果选择氯沙坦10-4mol/L作为干预药物浓度。（2）筛选Ang Ⅱ对线粒体自噬作用最强的浓度和时间:Western blot测定不同浓度对于H9C2心肌细胞的P62、Atg5、Beclin-1和LC3B Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达水平,结果显示在10-7mmol/L和24h时线粒体自噬水平最高。（3）流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率:从Ang Ⅱ组心肌细胞凋亡率情况来看,和Control组进行对比出现了明显的上升（P＜0.01）。与Control组相比,AngⅡ+Diazoxide组内部的心肌细胞凋亡率出现了显著上升,5-HD和氯沙坦抑制AngⅡ诱导的心肌细胞的凋亡（全部P＜0.01）。（4）氧化应激反应:与Control组相比,Ang Ⅱ组心肌细胞内ROS的浓度和NADPHase活性增加,摄氧能力下降（均P＜0.05）。Ang Ⅱ+Diazoxide组ROS浓度和NADPHase活性增加,摄氧能力下降;Ang Ⅱ+5-HD和Ang Ⅱ+ARB组心肌细胞的ROS浓度和NADPase活性降低,心肌细胞的摄氧能力升高,与Ang Ⅱ相比均有显著性差异（P＜0.05）。（5）ATP水平:与Control组相比,Ang Ⅱ组H9C2心肌细胞的ATP的生成降低（P＜0.01）。Ang Ⅱ+Diazoxide组H9C2心肌细胞胞内ATP的含量降低,与Control 组有显著性差异（P＜0.01）。Ang Ⅱ+5-HD、Ang Ⅱ+ARB 作用后 ATP 含量约是增加,与Ang Ⅱ组均有显著性差异（均P＜0.01）。（6）自噬小体:免疫荧光显微镜下观察转染LC3B的荧光蛋白,与Control组相比,Ang Ⅱ组及Ang Ⅱ+Diazoxide组的自噬小体显示增加,Ang Ⅱ+5-HD和Ang Ⅱ+ARB组自噬线体荧光蛋白明显减少。（7）线粒体自噬蛋白:与Control组相比,Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+Diazoxide组心肌细胞中P62的蛋白表达降低、Beclin-1和LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ的表达增加;AngⅡ+5-HD、Ang Ⅱ+ARB 组的 P62 表达增加,Beclin-1 和 LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ 的表达降低（均 P＜0.05）。（8）KATP 通道蛋白:与 Control 组相比,Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+Diazoxide 组中心肌细胞的Kir6.2、SUR2A、MITOK和MITOSUR蛋白表达显著增加,Ang Ⅱ+5-HD组Kir6.2和SUR2A表达降低,Ang Ⅱ+ARB组的MITOK和MITOSUR表达减少,与Ang Ⅱ组相比均具有显著性统计学差异（均P＜0.05）。结论1.氯沙坦改善心梗后心衰的心脏功能,降低缺血心肌细胞线粒体自噬水平;2.氯沙坦阻断mitoKATP开放抑制心肌细胞的线粒体自噬;3.氯沙坦降低心肌细胞mitoKATP通道的表达,抑制线粒体自噬。