【摘 要】
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动物肉产品是人类重要的蛋白质来源,随着人民生活水平的提高,对动物肉产品由“量”的需求发展到“质”的需求,优质地方鸡种具备的优良特点使其成为优质的肉产品。胚胎期肌肉生长发育决定整个肌肉过程,鸡胚胎期肌肉发育调控机制的解析、候选基因的筛选及功能鉴定,为优质地方鸡种标记辅助选择和分子育种改良提供有效参考,对促进家禽种质资源的有效开发和利用具有理论价值和实践意义。本研究以城口山地鸡（国家级畜禽遗传资源）胚
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动物肉产品是人类重要的蛋白质来源,随着人民生活水平的提高,对动物肉产品由“量”的需求发展到“质”的需求,优质地方鸡种具备的优良特点使其成为优质的肉产品。胚胎期肌肉生长发育决定整个肌肉过程,鸡胚胎期肌肉发育调控机制的解析、候选基因的筛选及功能鉴定,为优质地方鸡种标记辅助选择和分子育种改良提供有效参考,对促进家禽种质资源的有效开发和利用具有理论价值和实践意义。本研究以城口山地鸡（国家级畜禽遗传资源）胚胎第12天（E12）、16天（E16）、19天（E19）、21天（E21）腿肌为试验材料,利用RNA-seq技术探究胚胎不同时间段肌肉发育规律,筛选在时间序列中差异表达的m RNAs和lnc RNAs;通过生物信息学手段预测lnc RNAs的功能,构建胚胎期肌肉发育的分子调控网络,并在个体水平和细胞水平对候选基因进行功能初步探索。主要结果如下:（1）利用HE染色探究胚胎期肌肉发育规律。结果显示,城口山地鸡腿肌肌纤维存在与罗曼蛋鸡和白羽肉鸡不同的发育状态,城口山地鸡腿肌肌纤维在E12时完整形态结构尚未形成,而其他两种鸡在E12已形成完整肌纤维结构。肌纤维直径和面积统计结果表明,随胚胎发育时间的变化,城口山地鸡肌纤维直径和面积出现极显著增加（P＜0.01）;城口山地鸡肌纤维直径和肌纤维面积在E21显著（P＜0.05）小于白羽肉鸡和罗曼蛋鸡,且白羽肉鸡肌纤维直径和肌纤维面积显著大于罗曼蛋鸡（P＜0.05）。（2）构建了12个城口山地鸡胚胎期腿肌c DNA文库（E12-1、E12-2、E12-3、E16-1、E16-2、E16-3、E19-1、E19-2、E19-3、E21-1、E21-2和E21-3）。（3）对12个c DNA文库进行m RNA测序,共鉴定出16,330个m RNAs,包括109个新预测m RNAs转录本,差异表达分析筛选出6,726个差异表达基因（DEGs）;通过时间序列分析解析DEGs在不同时间点的时空表达模式,构建DEGs表达趋势聚类图;此外,对不同阶段差异比较分析结果进行Venn,筛选出50个在不同时间点差异表达的候选基因,并对50个候选基因进行时序表达模式分析和功能注释。（4）对12个c DNA文库进行lnc RNA测序,共鉴定出9,107个lnc RNAs转录本,包括874个新lnc RNA转录本;通过不同时间点差异比较分析共筛选出1,057个差异表达的lnc RNA。（5）对lnc RNA与蛋白编码基因进行关联分析,预测参与antisense、cis和trans调控作用的lnc RNAs及其靶基因,构建m RNA-lnc RNA基因调控网络;对发挥不同生物学作用lnc RNAs的靶基因进行功能注释,其中,GO功能分析发现大量转录调控和肌肉发育过程相关的条目被显著富集（P＜0.05）,而KEGG pathways分析显示大量与肌肉发育相关的分子代谢通路被显著富集（P＜0.05）,表明lnc RNAs可能通过影响这些蛋白编码基因的表达进而参与到肌肉发育的生物学调控。（6）筛选得到lnc RNA 7280.4及其靶基因STMN1,探究了lnc RNA 7280.4及其靶基因STMN1在肌肉组织水平的表达规律。组织表达谱发现两者在腿肌和胸肌中高表达;lnc RNA 7280.4和STMN1在城口山地鸡、罗曼蛋鸡和白羽肉鸡E12胸肌和腿肌均出现高表达,随胚胎发育时间的推移,lnc RNA 7280.4和STMN1均出现显著下调表达（P＜0.05）;lnc RNA7280.4和STMN1的表达相关性分析发现其在不同组织中均具有高度的相关性,进一步表明lnc RNA 7280.4通过调控STMN1表达进而影响肌肉发育。（7）lnc RNA7280.4及其靶基因STMN1细胞功能初步探索。结果显示,STMN1和lnc RNA 7280.4随增殖时间的变化表达量出现显著变化（P＜0.05）;随着成肌细胞分化时间的推移（成肌细胞分化和肌管融合）,STMN1和lnc RNA7280.4表达逐渐降低,与胸肌和腿肌组织不同发育时间STMN1和lnc RNA 7280.4表达模式相似。本研究通过对城口山地鸡胚胎腿肌不同时间点肌肉发育相关m RNAs和lnc RNAs的筛选和鉴定以及lnc RNA 7280.4/STMN1功能的初步探索,为深入探究城口山地鸡肌肉发育过程中的分子机制提供了数据基础,为进一步对城口山地鸡进行标记辅助选择和分子育种改良提供了有效参考依据。
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