放射治疗是治疗恶性肿瘤的有效手段之一，电离辐射可直接杀死肿瘤细胞，或诱导其凋亡及自噬的发生。凋亡是细胞受到外界因素作用后发生的一种程序性细胞死亡，国内外学者对细胞凋亡的研究较多且较为深入。凋亡过程涉及多种通路，包括内源性凋亡通路（即线粒体凋亡通路），外源性凋亡通路（即死亡配体/受体通路），内质网通路及自噬等，各通路之间可互相影响，如外源性及内源性通路间可相互交叉，进而放大凋亡效应。目前，对恶性肿瘤的研究多集中在药物对肿瘤细胞的作用或肿瘤细胞的辐射增敏剂作用，而关于不同辐射敏感性的肿瘤细胞，特别是具有辐射抗性的恶性肿瘤凋亡机制的研究较少。本研究旨在探索辐射抗性肿瘤细胞凋亡通路的分子机制，为提高肿瘤放疗疗效提供理论依据。研究目的：观察辐射作用后的肺癌和骨肉瘤细胞凋亡通路相关分子的表达变化，阐明辐射抗性肿瘤细胞的凋亡机制。研究方法：选取非小细胞肺癌细胞系（辐射抗性的A549和辐射敏感的H460）和骨肉瘤细胞系（HOS）进行实验，并利用逆转录病毒转染方法建立shNRP1-A549稳定表达细胞模型，采用流式细胞术检测电离辐射作用后肿瘤细胞的凋亡率及周期进程，进一步应用qRT-PCR及Western blot法检测细胞凋亡相关分子的mRNA及其蛋白水平变化，探讨凋亡通路在辐射抗性肿瘤细胞中的作用机制。研究结果：1.辐射抗性肿瘤细胞受照后凋亡率和细胞周期进程的变化10Gy X射线照射后A549、H460、HOS及shNRP1-A549细胞与假照组相比凋亡率均增加，辐射敏感的H460细胞及shNRP1-A549细胞凋亡率明显高于A549和HOS细胞，说明A549和HOS细胞具有较高的辐射抗性。细胞周期进程的结果显示，A549和shNRP1-A549细胞受照后G2/M期比例较假照组升高，且shNRP1-A549细胞的升高变化较亲本A549细胞更明显，说明干扰NRP1基因表达后，出现明显的G2/M期阻滞，增强对辐射的敏感性。2.辐射抗性肿瘤细胞中内源性凋亡通路相关分子转录及蛋白水平变化10Gy X射线作用后，A549细胞Caspase-9基因转录水平高于假照组，HOS细胞却有所下降但变化不显著，而shNRP1-A549和H460细胞Caspase-9基因转录水平显著高于假照组。促凋亡基因Bax转录水平在受照后的A549及H460细胞中均升高，但具有辐射抗性的A549细胞中升高幅度只是假照组的2-3倍，HOS细胞中的转录水平低于假照组，而在H460细胞中升高幅度达到假照组的35倍。抗凋亡基因Bcl-xL转录水平在辐射抗性A549及HOS细胞中升高，而在辐射敏感的H460细胞中无明显变化。本实验结果表明，电离辐射可通过激活辐射抗性肿瘤细胞的内源性凋亡通路，但其凋亡通路中的促凋亡基因的升高程度低于辐射敏感的细胞，在其过程中起关键作用的是抗凋亡基因Bcl-xL。在10Gy X射线作用后，内源性凋亡通路相关蛋白水平变化与转录水平变化不完全一致，H460细胞的抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达水平高于假照组，而在HOS细胞中却几乎不表达，在shNRP1-A549细胞中的表达变化不明显,但在A549细胞中Bcl-xL的mRNA及蛋白表达水平均高于假照组；shNRP1-A549中促凋亡基因Bax的mRNA及蛋白表达水平均高于假照组，但其蛋白表达水平较亲本A549细胞低。说明辐射抗性肿瘤细胞的凋亡机制中，内源性凋亡通路蛋白可能在转录后水平上进行调控。3.辐射抗性肿瘤细胞中外源性凋亡通路相关分子转录及蛋白水平变化10Gy X射线作用后，在外源性凋亡通路基因在辐射抗性肿瘤细胞中表达变化具有细胞特异性，即肺癌细胞与骨肉瘤细胞中的表达变化并不一致，但在肺癌细胞中具有辐射抗性的A549细胞和辐射敏感性高的H460细胞中Caspase-8和Caspase-6基因表达变化却相反，而Caspase-3的转录水平变化是一致的。说明在肺癌细胞辐射抗性中外源性凋亡通路起重要作用，而在辐射不敏感性的骨肉瘤（HOS）细胞中却没有明显的作用。10Gy X射线作用后，外源性凋亡通路相关蛋白在辐射抗性肿瘤细胞中表达变化与转录水平的变化基本一致。进一步研究发现，干扰辐射抗性相关基因——NRP1以后，受照射的shNRP1-A549细胞中外源性凋亡相关蛋白表达变化与辐射敏感度的H460细胞中的变化相似，进一步证实外源性凋亡机制在肺癌细胞辐射抗性中起重要作用。4.辐射抗性肿瘤细胞中凋亡相关的酶类基因的转录及蛋白水平变化本实验检测凋亡相关的酶类的表达变化，探讨其机制。研究发现，10Gy X线作用后，在辐射抗性A549及HOS细胞中，PARP的转录水平较一致，在H460细胞中该基因的转录水平较假照组低。PARP蛋白及Cleaved PARP蛋白在辐射抗性A549及HOS细胞中的表达趋势较一致，在H460细胞中PARP蛋白的表达明显降低，Cleaved PARP蛋白的表达明显升高。敲低NRP1的表达后，A549细胞中的Cleaved PARP蛋白未表达，而亲本A549细胞中Cleaved PARP蛋白高于假照组，shNRP1-A549细胞中PARP蛋白的表达较亲本A549细胞低。表明干扰NRP1的表达后，PARP基因的表达受到抑制，并且PARP蛋白未发生剪切，从而使细胞对电离辐射更加敏感，此结果说明DNA修复蛋白酶PARP在辐射抗性肿瘤细胞的凋亡机制中起重要作用。MMP-2基因的转录水平在辐射抗性及辐射敏感性细胞中均增高，但其蛋白表达水平却较假照组略降低，该基因转录与翻译水平上的差异表明该蛋白的表达在转录后水平上调控，辐射抗性及辐射敏感性细胞中MMP-2基因的转录及翻译水平的变化一致，表明MMP-2基因与肿瘤细胞的辐射抗性无明显关联。结论：1.10Gy X射线照射后辐射抗性的肺癌细胞和辐射不敏感的骨肉瘤细胞凋亡率虽然高于假照组，但其升高幅度低于辐射敏感的肺癌细胞。2.在辐射抗性肿瘤细胞的凋亡过程中，内源性凋亡通路相关分子Caspase-9及Bax和抗凋亡蛋白Bcl-xL起关键作用。3.在辐射抗性肺癌细胞中外源性凋亡通路相关分子Caspase-6起重要作用，而Caspase-8及Caspase-3的作用不明显。4.在辐射抗性肿瘤细胞中凋亡相关的酶类PARP活性受抑制,而MMP-2基因与蛋白表达变化与肿瘤细胞的辐射抗性无明显关联。