论文部分内容阅读
水通道蛋白4在缺血性脑水肿中的作用机制研究 水的跨膜转运与生命活动息息相关，随着1988年第一个水通道蛋白（AQP）被发现，并于1997年被正式命名，由此为水分子跨膜转运提供了分子结构依据。并认为极性水分子透过以脂质双分子层为特征的细胞膜是经水通道蛋白介导。从而使得水分子在以脂质双分子层为特征的细胞膜上转运的分子机制得以阐明。修饰AQP的分子结构或表达水平使其功能状况发生改变可达到调节细胞膜水通透性的目的，AQP的功能改变将可能成为许多以水代谢障碍为主要特征的疾病的中心环节，随着研究的深入有望成为新的治疗突破点。 目前已发现的水通道蛋白有11种，它们的分布有相对的组织特异性。脑内主要存在的是AQP1和AQP4，而且AQP4主要分布在血脑屏障的两侧。使用不同方法修饰AQPs可达到调节、改变细胞膜对水的通透性的目的。已有研究发现剔除AQP4基因的小鼠在正常状态下除肾脏浓缩功能轻度损伤外无明显异常表现，但在给予脑缺血后发现这种剔除了AQP4基因的小鼠的脑水肿程度明显较正常小鼠轻。因此如果对脑组织中的AQP4进行功能修饰可能将给脑水肿的治疗带来新的希望。 基于国内目前尚未见到有关水通道蛋白4在神经系统的研究报道，国外查新所见到的水通道蛋白4与脑卒中的相关文献也较少，所见文献主要集中在2000年以后的少数核心期刊中，由此说明该领域正逐渐引起人们的注意和重视。对此我们做了以下几方面的工作。 一、大鼠水通道蛋白4基因克隆与载体的构建 目的 克隆大鼠水通道蛋白4（AQP4）基因并构建其载体为进一步研究提供理论基础和研究工具。方法 提取正常健康SD大鼠小脑皮质总RNA，采用随机引物法进行逆转录构建大鼠小脑cDNA文库，应用自行设计的两对AQP4特异性引物，进行AQP4特异性扩增；第一对引物：上游引物：5’-GTT ATC ATG GGA AAC TGG GAAA-3’、下游引物：5’-TAC CTC TCC AGA CGA GTC CTTC-3’；第二对引物：上游引物：5’-TATC GAA TTC ATG AGT GAC GGA GCT GCA GCG AGG CG-3’、下游引物：5’-TAT GC GGC CGC TCA TAC AGA AGA TAA TAC CTCT-3’。前者扩增的片段直接插入pCRTMⅡ质粒中，后者利水通道蛋白4在缺血性脑水肿中的作用机制研究摘要用设计的酶切位点进行相应的内切酶酶切后插入PcDNA3 .1 zeo（+）质粒中。结果两对引物分别扩增出片段长度为294bp和993bp的两个片段，前者为AQP4全段序列的一部分，相当于664一957，后者则为AQP4序列的全段（参照基因Bank的登记号为u14007的序列），二者分别正确插入到pc彭Mn质粒和PcDNA3 .1 zeo（+）质粒中。并由上海生工生物工程技术公司进行测序，测序结果与U14007报道的序列相同。结论本实验正确克隆了AQP4基因并成功构建了其载体，该基因片段和全段基因及其载体可以用于进一步研究的工具。二、AQP4在正常大鼠脑内的表达与分布研究 目的明确正常大鼠脑内AQP4的表达与分布，为进一步研究提供理论依据。方法采用本实验室构建的AQP4 cRNA探针和购买的美国ADI公司生产的AQP4单克隆抗体，同时对正常sD大鼠脑的冰冻切片进行原位核酸分子杂交和免疫组织化学检测AQP4基因和蛋白的表达水平。结果免疫组织化学染色结果显示阳性着色细胞主要有胶质细胞、毛细血管内皮细胞、脑室室管膜上皮细胞，其次为脑室脉络丛上皮细胞，着色部位主要在细胞膜，其中在胶质细胞表现出一定的方向性、主要分布在与毛细血管内皮细胞接触的一侧。原位核酸分子杂交结果显示阳性细胞比较广泛，包括:胶质细胞、毛细血管内皮细胞、脑室室管膜上皮细胞、脑室脉络丛上皮细胞、海马神经元、小脑Purkinje氏细胞、脑干神经核团神经元、下丘脑神经元以及部分皮质神经元。结论AQP4在正常大鼠脑内具有广泛的表达，主要表达分布于与血脑屏障相关的毛细血管内皮细胞及其相连的胶质细胞，其次是脑室室管膜上皮细胞、脉络丛上皮细胞和下丘脑神经元。依据结构与功能相联系的原则，其表达的解剖分布提示AQP4在脑内主要参与脑内的水代谢以及全身水代谢的调节。三、大鼠脑缺血再灌注损伤过程中AQP4表达水平的变化及其与脑损伤的相关性研究 目的探讨AQP4在大鼠脑缺血再灌注损伤过程中表达水平的动态变化，并分析其与脑损伤、脑水肿形成等的相关性。方法采用SD大鼠复制脑局限性缺血再灌注模型（缺血2小时再灌注3h、6h、12h、24h、72h、7d），应用免疫组织化学方法检测脑内AQP4蛋白以及构成血脑屏障紧密连接的主要组成成分之一的20一1蛋白水平的动态变化，并对它们进行半定量分析。同时观察记录大鼠生命体征的变化以及血脑屏障通透性、神经功能缺损程度、脑水肿程度的的动态变化。利用统计学处理分析卒中后脑内AQP4蛋白水平的变化与脑水肿、血脑屏障破坏以及神经功能缺损程度的相关性。结果1.大鼠在脑缺血损伤手术过程水通道蛋白4在缺血性脑水肿中的作用机制研究摘要中各项生命体征保持平稳。2.脑局限性缺血再灌注损伤后脑内AQP4蛋白水平迅速发生明显的变化，卒中后其水平迅速降低，至再灌注损伤后12一24小时达?