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目的:地方性氟中毒在许多国家仍然是一个主要的公共卫生问题。氟可引起异常成骨细胞增殖和活化,导致氟骨症。然而其详细的分子机制尚不清楚。本研究在既往发现细胞周期调控关键分子Cyclin D1高表达参与氟骨症成骨细胞增殖活跃基础上,开展了燃煤污染型氟暴露人群和体外实验研究,探讨miR-4755-5p通过靶向调控Cyclin D1在氟骨症成骨细胞增殖活化中的作用。本研究旨在探讨micro RNA（miRNA）在氟骨症发病机制中的作用,为最终应用miRNA治疗氟骨症提供科学依据。方法:1.依据地方性氟中毒病区划分标准（GB 17018-2011）,选择贵州省燃煤污染型氟中毒病区织金县荷花村为调查点,非氟中毒地区安顺市双堡镇张官村作为对照点。依据纳入排除标准,追踪既往调查对象共248人。在知情同意原则下收集调查对象血样及尿样。采用国家标准氟离子选择电极法测定尿氟（UF）含量,并根据所测得的UF浓度,将调查对象分为3组:（1）UF<1.96 mg/g Cr组,117例;（2）1.96 mg/g Cr≤UF<3.92 mg/g Cr组,65例;（3）UF>3.92mg/g Cr组,66例。分别采用微量酶标法和酶联免疫吸附法（ELISA）检测碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素（BGP）含量。使用miRWalk 3.0数据库（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de）的四种不同算法（包括miRwalk、miRDB、miRTar Base和Target Scan）预测靶向Cyclin D1的miRNA。在课题组前期miRNA-seq分析基础上,基于以下三个标准选择候选miRNA:miRNA测序结果中下调且差异表达的miRNA（P≤0.05 and|log2FC|≥1）;预测的结果至少为两种算法的交集;结合位点为3’UTR。采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）在248例调查对象中验证miR-4755-5p的表达;q RT-PCR检测Cyclin D1 m RNA表达;ELISA法检测Cyclin D1蛋白表达。2.收集骨科外伤手术健康人髂骨或股骨松质骨,采用酶消法分离人原代成骨细胞,通过细胞形态学观察、碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定人原代成骨细胞。以0、200、400、600、800、1000、1200、1400及1600μmol/L氟化钠（Na F）处理人成骨细胞24、48、72及96h,CCK-8法检测染氟人成骨细胞代谢活力;并根据CCK-8实验结果选择以0、600、1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72h进行后续试验,流式细胞术检测细胞周期分布;微量酶标法和ELISA法检测ALP活性和BGP含量;q RT-PCR检测miR-4755-5p表达;q RT-PCR检测Cyclin D1 m RNA表达;蛋白印迹法（Western-blotting）检测Cyclin D1蛋白表达。3.采用双荧光素酶报告基因检测验证miR-4755-5p与Cyclin D1的靶向结合。采用miR-4755-5p mimic和mimic NC转染人成骨细胞24h,q RT-PCR检测转染后miR-4755-5p表达,确定转染成功后,进一步用1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72 h,q RT-PCR检测miR-4755-5p表达;q RT-PCR检测Cyclin D1m RNA表达;Western-blotting检测Cyclin D1蛋白表达;CCK-8法检测细胞代谢活力;流式细胞术检测细胞周期分布;微量酶标法和ELISA法检测ALP活性和BGP含量。结果:1.在燃煤型氟暴露人群中,与低UF组比较,高UF组ALP活力和BGP含量增加,差异有统计学意义（P均<0.05）,表明,在氟暴露人群中观察到了氟暴露诱导的成骨细胞活化。基于课题组前期miRNA-seq结果和筛选标准,利用生物信息学软件在下调的miRNAs中筛选获得靶向Cyclin D1的miR-4755-5p。结果显示,与低UF组比较,高UF组miR-4755-5p表达逐渐降低（P<0.05）,Cyclin D1基因m RNA转录及蛋白表达逐渐增加（P均<0.05）。同时,miR-4755-5p与Cyclin D1表达呈负相关(r蛋白=-0.72,P<0.05;rm RNA=-0.373,P<0.05),提示miR-4755-5p可能参与Cyclin D1的上调。2.随着染氟剂量的增加,人成骨细胞增殖指数（PI）、ALP活力及BGP含量逐渐升高（P均<0.05）,表明Na F处理可致成骨细胞的异常增殖和活化。同时,随Na F剂量的增加,miR-4755-5p表达逐渐降低（P<0.05）,Cyclin D1基因m RNA转录及蛋白表达逐渐增加（P均<0.05）,表明Na F可抑制人成骨细胞miR-4755-5p的表达,上调Cyclin D1的表达,此结果与前期的人群研究结果相一致。3.双荧光素酶报告基因实验表明miR-4755-5p通过靶向Cyclin D1的3’-UTR调控Cyclin D1的表达。成骨细胞转染miR-4755-5p mimic后miR-4755-5p的表达较对照组增加（P<0.05）,表明转染是成功的。与单纯Na F处理的成骨细胞相比,转染miR-4755-5p mimic后的Na F处理成骨细胞中,miR-4755-5p的表达增加（P<0.05）,Cyclin D1蛋白表达降低（P<0.05）,但Cyclin D1 m RNA表达无明显变化（P>0.05）,表明在Na F作用下,过表达miR-4755-5p后下调了成骨细胞Cyclin D1蛋白表达,明确了miR-4755-5p对Cyclin D1表达的调控。同时miR-4755-5p过表达后,人成骨细胞增殖指数（PI）、ALP活力及BGP含量降低（P均<0.05）。以上结果表明,在Na F作用下,过表达miR-4755-5p降低人成骨细胞中Cyclin D1蛋白表达后,可进一步抑制其细胞增殖和活化。但本研究未观察到miR-4755-5p过表达对Cyclin D1 m RNA的影响,表明miR-4755-5p可能通过抑制Cyclin D1蛋白的翻译而不是m RNA的降解来调控Cyclin D1的表达。结论:1.氟暴露可诱导miR-4755-5p低表达。2.低表达的miR-4755-5p通过上调Cyclin D1促进氟诱导的成骨细胞增殖活化。3.miR-4755-5p直接结合于Cyclin D1的3’-UTR影响其蛋白表达。