【摘 要】
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研究背景与目的:肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤,但其发病机制尚未完全阐明。在HCC的发生、发展过程中,泛素化-去泛素化系统发挥着非常重要的作用,本研究旨在探讨去泛素化酶USP53在肝细胞癌组织中和肝癌细胞系中表达及其对肝癌预后的影响,在此基础之上,进一步研究USP53对HCC生物学行为的影响及其具体分子机制。研究方法:从TCGA
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研究背景与目的:肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤,但其发病机制尚未完全阐明。在HCC的发生、发展过程中,泛素化-去泛素化系统发挥着非常重要的作用,本研究旨在探讨去泛素化酶USP53在肝细胞癌组织中和肝癌细胞系中表达及其对肝癌预后的影响,在此基础之上,进一步研究USP53对HCC生物学行为的影响及其具体分子机制。研究方法:从TCGA-LIHC数据库中下载肝癌组织基因表达信息,分析肝细胞癌组织和癌旁组织中USP53 m RNA表达水平的差异;利用KM Plotter数据库分析肝细胞癌中USP53 m RNA表达水平与患者复发和生存的关系。随后收集33对肝细胞癌组织和癌旁组织,检测USP53 m RNA和蛋白水平在癌组织和癌旁组织的表达量。提取5种肝癌细胞系和人类永生化肝细胞系L02的总RNA和总蛋白,并检测USP53在不同细胞系中的表达差异。通过质粒和慢病毒的方法,对USP53进行过表达,通过体内和体外方法探究USP53对肝细胞癌肿瘤生物学行为的影响,通过CCK-8、Ed U染色、克隆形成实验、划痕实验、trans-well试验、流式细胞学等实验检测细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡比例和周期分布,并构建小鼠皮下瘤模型和原位肝癌模型研究USP53在体内对肝细胞癌肿瘤生长的影响。接着用免疫沉淀和质谱分析的方法寻找USP53的互作分子,并通过免疫共沉淀（CO-IP）、邻位连接（Proximity Ligation Assay,PLA）、免疫荧光（IF）和GST-pull down验证其相互作用。为了研究其互作机制,我们进行了MG132降解实验和CHX稳定性试验,并对下游分子进行免疫沉淀后检测其泛素化程度改变。最后我们设计针对USP53和其下游分子的功能回复实验,通过CCK8、TUNEL荧光染色、流式细胞学凋亡检测、caspase-3活性检测等方法检测我们所观察到的功能是否可以被下游分子所回复。研究结果:在TCGA-LIHC队列中,肝癌组织中USP53 m RNA的表达量显著低于癌旁组织（P＜0.001）。根据KM Plotter数据库,USP53高表达患者总体生存期（P=0.0051）和疾病特异性生存期（P=0.0037）显著长于USP53低表达者。在肝细胞癌手术队列33对样本中,癌组织中USP53 m RNA和蛋白水平显著低于癌旁组织（P＜0.05）。肝癌细胞系HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L中USP53 m RNA和蛋白水平显著低于正常肝细胞L02。在Huh-7和HCCLM3细胞系中,划痕实验、trans-well试验、克隆形成实验、Ed U染色都证明了USP53过表达抑制肝细胞癌的迁移能力、侵袭能力和增殖能力,流式细胞学显示过表达USP53引起细胞凋亡比例增加和G1/S阻滞。动物实验中,USP53稳定过表达的HCCLM3细胞在小鼠体内形成的皮下瘤模型和原位肝癌模型中,肿瘤增长相比对照组都显著被抑制。通过文献学习,结合GSEA功能富集,在质谱分析结果中找到凋亡相关分子CYCS,并通过免疫共沉淀、免疫荧光、邻位连接、GST-pull down,验证了CYCS与USP53的直接相互作用关系。MG132和氯喹降解实验证明CYCS主要通过泛素化-蛋白酶体途径降解,CHX稳定性试验表明过表达USP53后CYCS蛋白稳定性增加,RNA水平没有改变。泛素化检测证明过表达USP53后CYCS泛素化程度降低。回复实验中共转染si-USP53和CYCS过表达质粒后,通过CCK8、tunel荧光染色、流式细胞学凋亡检测、caspase-3活性检测等检测到肝癌细胞凋亡程度比单纯过表达CYCS有所下降。结论:去泛素化酶USP53在肝细胞癌组织和细胞系中表达下调,其低表达与肿瘤恶性程度和不良预后相关。体内体外试验证实USP53在肝细胞癌中发挥着抑癌作用,通过去泛素化CYCS并增强了其蛋白稳定性,从而促进肝癌细胞凋亡,发挥抑制肝癌发生发展的作用。
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