研究背景和目的:皮肤光老化分为内源性光老化和外源性光老化,而日光中的紫外线辐射是造成外源性光老化的主要因素。长期的紫外线照射可使皮肤衰老提前发生,引起皮肤外观、结构及功能改变,皮肤光老化的主要改变是真皮层细胞外基质成分的变化,主要是Ⅰ型胶原纤维及少量Ⅲ型胶原纤维的减少。Ⅰ型胶原纤维主要是粗纤维,在维持真皮层固有结构中起到了重要作用,而Ⅲ型胶原主要是细纤维,对维持真皮组织弹性有重要作用。胶原纤维是皮肤结缔组织的重要成分,赋予皮肤坚韧性和伸展性。紫外线诱导的胶原降解主要是通过金属蛋白酶(MMP)的产生来完成的,其中又以MMP-1和MMP-3为主。金属蛋白酶是一组锌依赖性的能够降解细胞外基质的蛋白酶家族,MMPs通过水解、破坏及重组细胞外基质,维持胶原合成与降解之间的平衡,在皮肤的光损伤中起着重要作用。紫外线辐射可诱导成纤维细胞中的MMPs产生增加,MMPs可不断增加胶原降解,使长期光损伤皮肤的胶原缺乏,加重皮肤老化。而在其他的研究发现,可通过SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)化学染色法测定老化程度;给予一定量的UVB辐射可导致细胞中P53、P16、P21表达的变化。以往的研究已经证实反复低剂量UVB辐射可在体内外诱导出光老化模型,而这些模型在光老化研究中得到了广泛的应用。黄芩苷是中药黄芩的有效成分之一,是一种有效的化学光保护剂,有着广泛的生物学效应。现代药理研究表明,黄芩苷具有抗炎、抗菌、抗病毒、清除自由基及抗氧化、抗变态反应、抗肿瘤,神经系统保护等药理活性,在许多疾病模型中发挥着重要作用,比如缺氧所致心肌损伤模型、铁过剩鼠模型、类风湿关节炎模型等。有趣的是,近来有多个研究发现黄芩苷对急性UVB光损伤有保护作用,并且认为这种保护作用与黄芩苷减少了 UVB所致的氧化应激相关。然而,黄芩苷在UVB辐射诱导所致提前衰老中的作用及其机制有待进一步阐明。本研究的目的旨在通过反复多次UVB照射在体内外建立光老化提前衰老模型,观察黄芩苷在慢性光损伤中的作用以及对相关作用机制的探讨。研究方法:1.细胞培养人二倍体成纤维细胞(HDFs)取自成年健康男性包皮组织,由江苏省人民医院泌尿外科提供。37℃,5%CO2条件下用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。取5-10代对数生长期的细胞进行实验。2.实验动物及分组C57BL/6小鼠,雌性,6-8周,重约20-25g。随机分为6组:对照组、黄芩苷组、UVB组、UVB+丙酮组、UVB+黄芩苷(0.5mg/cm2)组、UVB+黄芩苷(1.0mg/cm2)组,每组5只小鼠。3.紫外线照射根据实验设计定时定量进行紫外线照射,细胞试验中,UVB每次辐射剂量为10 J/cm2,每天照射1次,连续5天。UVB处理细胞后,选择合适浓度的黄芩苷加入培养至相应时间点。动物实验中,在前两周,辐射剂量为60mJ/cm2;第三周,辐射剂量为120 mJ/cm2;第四周,辐射剂量为180 mJ/cm2;第5到8周,辐射剂量为240 mJ/cm2。4.细胞增殖活性CCK-8法检测细胞增殖活性。5.SA-β-Gal化学染色按照说明书进行操作,在光学显微镜下观察蓝染阳性细胞,随机选取3-5个视野进行阳性细胞计数,统计阳性细胞百分率。6.细胞周期收集细胞,加入200μLPI,震荡成单细胞悬液,避光室温静置30min,流式细胞仪检测细胞周期。7.老化相关蛋白检测Western Blot法检测老化相关蛋白p53、p16、p21及γ-H2AX表达量。8.HE染色观察各组小鼠皮肤中的表皮增厚及炎症浸润情况。9.免疫组化检测小鼠背部皮肤COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、MMP-1、MMP-3的表达情况。10.实时定量RT-PCR检测小鼠背部皮肤p53、p16、p21的mRNA表达情况。结果:1.黄芩苷对UVB辐射所致小鼠皮肤增厚有抑制作用表皮增厚可作为皮肤光老化的标志之一。我们检测了各组小鼠皮肤表皮的厚度,HE染色结果显示,UVB辐射组小鼠背部皮肤较正常对照组增厚4.23倍,而局部外用黄芩苷后小鼠皮肤增厚得到明显改善,差别有统计学意义。2.黄芩苷对UVB辐射所致小鼠皮肤胶原纤维减少有抑制作用Masson染色显示,与对照组相比,UVB组胶原水平下降了 68.17%,差别有统计学意义,而单纯外用黄芩苷对胶原表达量无明显改变。外用黄芩苷则可改善UVB辐射所致胶原水平下降。3.黄芩苷对UVB辐射所致小鼠皮肤COL-1和COL-3表达量减少有抑制作用免疫组化和实时定量RT-PCR结果显示,与对照组相比,UVB组中COL-1和COL-3表达量明显下降,差别有统计学意义。而单纯外用黄芩苷对COL-1和COL-3表达量无明显改变。外用黄芩苷则可改善UVB辐射所致COL-1和COL-3表达量下降。4.黄芩苷对UVB辐射所致小鼠皮肤MMP-1和MMP-3表达量增加有抑制作用免疫组化和实时定量RT-PCR结果显示,与对照组相比,UVB组中MMP-1和MMP-3表达明显量增加,差别有统计学意义。而单纯外用黄芩苷对MMP-1和MMP-3表达量无明显改变。外用黄芩苷则可改善UVB所致MMP-1和MMP-3表达量增加。5.黄芩苷对UVB辐射所致成纤维细胞增殖活性下降有抑制作用CCK8结果显示,与对照组相比,UVB组细胞增殖活性明显下降,差别有统计学意义。而单纯外用黄芩苷对细胞增殖活性无明显影响。外用黄芩苷则可改善UVB辐射所致细胞增殖活性下降。6.黄芩苷对UVB辐射所致成纤维细胞增SA-β-gal阳性表达升高有抑制作用空白对照组β-半乳糖苷酶染色阴性。UVB辐射后,大部分细胞染色阳性(胞质染为蓝色)。而UVB+黄芩苷组细胞蓝染面积明显减少,与UVB组相比,其S A-β-Gal细胞蓝染阳性率有明显降低,且差异有统计学意义,7.黄芩苷对UVB辐射所致成纤维细胞p16、p21及p53蛋白表达升高有抑制作用Western blot结果显示,与对照组相比,UVB组细胞p16、p21及p53蛋白表达量明显上升,差别有统计学意义。而单纯外用黄芩苷对p16、p21及p53蛋白表达量无明显影响。外用黄芩苷则可改善UVB辐射所致细胞p16、p21及p53蛋白表达量上升。8.黄芩苷长时间外用对正常培养成纤维细胞增殖活性无明显作用CCK8结果显示,外用黄芩苷8周后,成纤维细胞的增殖活性无明显变化,与正常对照组相比,差异无统计学意义。结论:本文的研究证实,在体内外实验中,黄芩苷对UVB诱导的提前衰老有明显的保护作用。黄芩苷可减轻UVB辐射诱导所致的增殖下降、胶原降解,金属蛋白酶生成增加,可能与调控与老化相关的p16、p21、p53从而发挥抗紫外线光损伤作用。黄芩苷可能成为治疗皮肤光源性损伤及光源性皮肤病的新选择。研究背景和目的:细胞衰老是一种永久性的增殖抑制状态,紫外线辐射等多种因素可诱导机体提前进入衰老状态,从而引起多种生物学指标异常。既往的研究已经证实反复的紫外线照射可诱导人皮肤成纤维细胞提前衰老。在提前衰老状态下,细胞停止分化,细胞形态和代谢发生一系列改变。体外研究发现这些细胞老化发生的机制可能与信号通路改变、端粒缩短、DNA损伤有关。自噬是真核细胞降解老化蛋白质和细胞器的主要方式之一,并与生物体的老化进程密切相关。自噬是机体应对应激状态(如紫外线照射、饥饿、蛋白质错误折叠等)的一种自我保护反应,这种反应在细胞内形成了一种闭合性膜的囊泡结构,用以吞噬和消化细胞内成分。已有研究证实,自噬的下降可加速老化的发生。但自噬在光老化中的作用以及其中的相关机制尚未得到验证。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种非编码单链小RNA分子,能够通过与基因3’UTR区碱基不完全或完全配对而导致靶mRNA降解或抑制其翻译,从而对基因进行转录后调控。近来越来越多的研究发现许多微小RNA参与了老化与衰老的进程。所以微小RNA可能成为预防和治疗老化潜在的靶位点。而已有研究发现微小RNA也参与了自噬的过程,但自噬及微小RNA在光老化中的作用尚未被研究清楚。MiR-23a可能是老化发生过程中的一个潜在靶位点,研究在体内外的老化模型中miR-23a表达明显上升。但miR-23a在UVB和PUVA诱导的提前衰老的模型中的作用尚未被阐明。本篇研究的目的旨在找出在两种提前衰老的模型中miR-23a与自噬之间的关系,并通过生物信息学的方法找到miR-23a的下游靶位点,进一步阐明miR-23a在自噬和老化调控中的机制。研究方法:1.细胞培养同第一部分内容2.紫外线照射根据实验设计定时定量进行紫外线照射,对于UVB-SIPS模型,UVB每次辐射剂量为10 J/cm2,每天照射1次,连续5天。对于PUVA-SIPS模型,在照射前予8-甲氧补骨脂(100 ng/ml)孵育24小时,UVA每次辐射剂量为9 J/cm2,每天照射1次,连续7天。3.细胞化学酶染色法检测SA-β-Gal同第一部分内容4.流式细胞仪检测细胞周期同第一部分内容5.MiR-23a下游靶点的生物信息学分析利用在线数据库TargetScan(http://www.targetscan.org/)、PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu/)和miRanda(http://microrna.sanger.ac.uk/_)等预测miR-23a 靶基因,采用 RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)在线分析系统对miR-23a及选取出的相关靶基因基因片段的可能结合位点进行分析,结果显示其与AMBRA1存在一个可能的结合位点,通过双荧光素酶报告法来检测有效结合位点。6.Western Blot法同第一部分内容7.免疫共沉淀检测vps34与Beclin1的相互作用结果:1.UV-SIPS模型中自噬水平激光共聚焦显微镜结果显示,与对照组相比,UV组成纤维细胞GFP-LC3阳性率明显下降,差异有统计学意义。免疫印迹结果显示,与对照组相比,UV组成纤维细胞LC3II/LC3I明显下降,p62/SQSTM1明显升高,差别有统计学意义。2.UV-SIPS模型中老化水平紫外线照射后,与对照组相比,UV组成纤维细胞SA-β-半乳糖苷酶阳性率、p16、p53和p21的蛋白表达量、G1期阻滞率明显上升,EdU阳性率明显下降,差异有统计学意义。3.UV-SIPS模型中miR-23a～27a—24-2的表达量RT-PCR结果显示,与对照组相比,miR-23a的表达量在UVB-SIPS模型和PUVA-SIPS模型均明显下降,差异有统计学意义;与对照组相比,miR-24-2的表达量在UVB-SIPS模型和PUVA-SIPS模型中均无明显改变,差异无统计学意义;与对照组相比,miR-27a的表达量在UVB-SIPS模型明显下降,差异有统计学意义,在PUVA-SIPS模型中无明显改变,差异无统计学意义。4.沉默miR-23a对UV-SIPS模型自噬水平的影响与UV-SIPS组相比,miR-23a+UV-SIPS组GFP-LC3 阳性率明显上升,差异有统计学意义;LC3II/LC3I明显增加,p62/SQSTM1明显下降,差别有统计学意义。5.沉默miR-23a对UV-SIPS模型老化水平的影响与UV-SIPS组相比,miR-23a+UV-SIPS组SA-β-半乳糖苷酶阳性率、p16、p53和p21的蛋白表达量、G1期阻滞率明显下降,EdU阳性率明显升高,差异有统计学意义。6.AMBRA1可能是miR-23a的下游靶位点双荧光素酶报告法验证AMBRA1是miR-23a的下游靶位点。RT-PCR和western blotting结果显示,沉默miR-23a可抑制AMBRA1表达。7.过表达miR-23a对雷帕霉素引起的自噬和老化水平变化的影响与UV-SIPS组相比,Rapa+UV-SIPS组SA-β-半乳糖苷酶阳性率、p16、p53和p21的蛋白表达量、G1期阻滞率明显下降,EdU阳性率明显升高,差异有统计学意义。与UV-SIPS 组相比,Ago-23a+Rapa+UV-SIPS 组 SA-p-半乳糖苷酶阳性率、p16、p53和p21的蛋白表达量、G1期阻滞率明显下降,EdU阳性率无明显变化,差异无统计学意义。与UV-SIPS组相比,Rapa+UV-SIPS组GFP-LC3阳性率明显上升,差异有统计学意义;LC3II/LC3I明显增加,p62/SQSTMI明显下降,差别有统计学意义。与 UV-SIPS 组相比,Ago-23a+Rapa+UV-SIPS 组 GFP-LC3 阳性率、LC3II/LC3I、p62/SQSTM1无明显变化,差别无统计学意义。8.过表达miR-23a对上调AMBRA1引起的自噬和老化水平变化的影响与 Ad-AMBRA1+UV-SIPS 组相比,Ad-AMBRA1+Agot-23a+UV-SIPS 组 SA-β-半乳糖苷酶阳性率、p16、p53和p21的蛋白表达量、G1期阻滞率明显下降,EdU阳性率无明显变化,差异无统计学意义。与Ad-AMBRA1+UV-SIPS组相比,Ad-AMBRA1+Agot-23a+UV-SIPS 组 GFP-LC3 阳性率、LC3II/LC3I、p62/SQSTM1蛋白无明显变化,差别无统计学意义。结论:本文的研究证实,在两种紫外线诱导的提前衰老模型中,自噬水平下降,老化上升。沉默miR-23a可改善紫外线诱导所致自噬水平下降和老化水平上升。MiR-23a可能与通过调控其下游靶位点AMBRA1来自噬水平进而进一步改善老化水平。MiR-23a可能成为治疗皮肤光源性损伤及光源性皮肤病的新靶点。