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氨基葡萄糖(Glucosamine)简称氨糖(Glc N),广泛的存在于动物、植物以及微生物中。乙酰氨基葡萄糖(Glc NAc)作为Glc N的乙酰化产物也有着良好的生产销售市场。随着生物学的发展,Glc N的生产由传统的甲壳素水解法逐渐转变为现在比较流行的微生物发酵法,而后者主要依赖于微生物菌株代谢途径的改造。本研究首先利用双启动子载体p ETDuet-1,在E.coli BL21(DE3)菌株中异源过表达Glc N合成关键蛋白氨基葡萄糖合成酶(Glms)与乙酰氨基葡萄糖合成酶(Gna1);其次基于Red同源重组技术,发现能够影响大肠杆菌Glc N产量的新基因yoa D与yoa E,探究新基因的缺失对于Glms酶活以及Glc N产量的影响;最后敲除了Glc N胞内转运关键基因man X,研究了碳源、温度和p H对工程菌Glc N合成的影响,具体包括以下三个方面:(1)氨基葡萄糖合成酶(Glms)与乙酰氨基葡萄糖合成酶(Gna1)是Glc N合成的关键蛋白。本研究使用p ETDuet-1质粒对glms基因(来源于菌株Bacillus subtilis168)与gna1基因(来源于菌株Saccharomyces cerevisiae S288C)进行异源过表达,通过构建质粒p ETDuet-1-bsglms-scgna1并将其成功转入E.coli BL21(DE3)感受态,最终成功构建了E.coli BL21-bsglms-scgna1工程菌株。在低温条件下成功诱导Glms(分子量为65 k Da)与Gna1(分子量为18 k Da)蛋白的表达。(2)yoa D与yoa E基因是编码大肠杆菌细胞膜蛋白的基因,分别具有刺激第二信使循环di-gmp的降解与调控某些离子的转移的功能,其对Glc N合成的影响目前尚未有报道,本论文利用Red同源重组技术在E.coli BL21(DE3)菌株中构建了E.coli BL21-△yoa D、E.coli BL21-△yoa E以及E.coli BL21-△yoa D-△yoa E三株工程菌,随后将载体p ETDuet-1-bsglms-scgna1转入上述3株工程菌株中,构建了工程菌株E.coli BL21-△yoa D-bsglms-scgnal、E.coli BL21-△yoa E-bsglms-scgnal以及E.coli BL21-△yoa D-△yoa E-bsglms-scgnal。结果显示基因yoa D与基因yoa E的共缺失可以将外源Glms的表达活性提高2倍,并且Glc N的产量达到了1.39 g/L,较原始E.coli BL21提高了3倍左右。(3)为进一步提高Glc N的合成量,对能够将细胞外的Glc N转运到细胞内的蛋白Man X基因序列进行敲除,构建工程菌株E.coli BL21-△yoa D-△yoa E-△man X;随后构建工程菌株E.coli BL21-△yoa D-△yoa E-△man X-bsglms-scgnal并以此为出发菌株,研究了碳源、温度、p H对氨糖发酵的影响。结果发现果糖的添加可以增加Glc N 20%左右的产量。在最优的培养条件下,E.coli BL21-△yoa D-△yoa E-△man X-bsglms-scgnal菌株在发酵时使Glc N与Glc NAc的产量分别达到了1.80 g/L与0.80g/L,相比于原始E.coli BL21菌株分别提高了大约4.0倍与2.0倍。