猪圆环病毒3型（Porcinecircovirustype3,PCV3）可引起猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍、心脏和多系统炎症等。2015年该病毒在美国被检出以来,在我国多个省份的猪群中被检测到。PCV3基因组大小约2000bp,其中Cap蛋白基因序列和PCV2的同源性为37%。PCV3常和其他病原体混合感染,感染猪后与PCV2的临床症状相似,加大了对该病毒的防控难度。因此,建立特异、快速、准确且敏感的PCV3检测方法,将对该病原的早期诊断和预防控制具有重要意义。本研究通过对Gen Bank中收录的不同国家和地区的PCV3全基因序列进行比对分析,针对保守序列设计特异性引物PCV3F/R。以PCV3F/R为引物,PCV3基因组为模板进行PCR扩增,建立PCR检测方法,构建p MD19-T重组克隆载体。分别在引物PCV3F/R 5′端分别标记生物素和地高辛,链霉亲和素作为包被抗原,将标记生物素和地高辛的引物PCR扩增产物作为一抗,HRP标记的地高辛Ig G作为二抗进行ELISA反应,建立PCV3PCR-ELISA检测方法,并进行特异性、敏感性和重复性检测。同时根据PCV3F/R基因序列设计一对特异性引物建立PCV3 SYBR Green II q PCR检测方法,对建立的PCV3 PCR-ELISA检测方法进行比对分析。最后通过收集132份临床样品,分别使用常规PCR、PCR-ELISA和荧光定量PCR进行实际检测分析,并对PCR检测阴性,PCR-ELISA和q PCR检测阳性的样品接种PK-15细胞培养72h。待病毒增殖后,提取PCV3病毒DNA,进行常规PCR检测,从而验证PCR-ELISA的灵敏度和准确性。结果发现,PCR所扩增的目的片段大小为392bp,检测到基因序列同Gene Bank上发表的PCV3基因同源性为100%。经过对PCR-ELISA的反应条件进行优化,确定最终条件为:链霉亲和素质量浓度2.5μg/m L,包被条件为37℃包被30min,5%的脱脂奶封闭液于37℃封闭1h,目的基因经PCR扩增后加入酶标板于37℃孵育1h,HRP标记的抗地高辛抗体稀释2000倍后于37℃孵育30min,TMB显色10min,最后使用酶标仪测定D450nm。常规PCR检出限为5.58×104copies/μL,PCR-ELISA检出限为5.58×102copies/μL,比常规PCR的敏感度提高了100倍,且该方法与PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV及PPV不发生交叉反应,批内重复性和批间重复性变异系数均低于10%。对收集到的132份猪的组织和血清样品进行PCV3检测,普通PCR检测出6份阳性,PCR-ELISA方法和荧光定量PCR方法检出结果一致,均检出12份阳性样品,PCV3阳性率为9.1%,高于常规PCR检出率4.55%,其中PCR-ELISA阳性,常规PCR阴性的样品共6份。将常规PCR检测阴性,PCR-ELISA与q PCR检测阳性的样品接种PK-15细胞培养72h后,常规PCR检测结果为阳性。以上结果表明,本试验成功建立了用于PCV3检测的PCR-ELISA方法,且该方法具有经济、快速、灵敏、安全、高效的特点,为PCV3的批量筛查、流行病学调查和预防控制提供了技术支持。