论文部分内容阅读
鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBD virus,IBDV）引起的一种急性免疫抑制性疾病,该病发病率较高且潜在传播范围较广,极易对家禽养殖业造成较大的经济损失。而病毒感染宿主时可以利用质膜-内膜之间的膜循环将自身伪装成宿主自身的一部分从而实现免疫逃逸。膜循环通常涉及囊泡运输及膜融合的过程。ADP核糖基化因子6（ADP-ribosylation factor 6,ARF6）是一种GTP酶,能够调节内吞及囊泡运输过程,并且已被证实在不同病毒感染时发挥的作用也表现出差异。IBDV的相关研究发现,多功能蛋白VP3具有与内膜结合的能力,能利用宿主膜进行复制从而逃脱宿主细胞的监视,但ARF6对IBDV感染的影响未见报道;干扰素诱导的跨膜蛋白3（Interferon-inducible transmembrane protein 3,IFITM3）是天然免疫系统的效应蛋白,它对多种包膜病毒的感染具有强大的细胞内在抵抗力,主要通过介导宿主内膜物理特性的变化来抑制病毒膜-内体膜融合从而实现阻止病毒增殖。IFITM3已被证实存在于禽类细胞且能够抵抗抗流感病毒等,但针对IBDV这类无囊膜病毒,其作用及机制尚不清楚。因此,本论文以雏鸡为研究对象,探究IBDV感染对ARF6的影响及对IFITM3的转录表达影响,并利用DF-1细胞,从细胞内膜的角度尝试探讨ARF6及IFITM3对IBDV感染及复制的调控作用机制,解析IBDV致病机制的新途径。本课题拟从以下方面进行开展研究。1.IBDV感染对雏鸡法氏囊和DF-1细胞中ARF6表达的影响本实验将IBDV分别感染雏鸡和鸡成纤维细胞（DF-1）进行体内实验和体外实验,并收集感染后不同时间的样品,通过免疫组化、实时定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）和Western Blot（WB）的方法检测鸡法氏囊组织的病理变化和Arf6的表达变化以及DF-1细胞中Vp2、ARF6和VP3的表达水平变化。结果显示:（1）与对照组相比,IBDV-VP3蛋白在感染后3天、5天和7天的法氏囊中均有表达,且在第3天表达最高,随后下降;（2）IBDV感染法氏囊后引起Arf6表达显著上调（P＜0.05）;（3）与对照组相比,IBDV感染DF-1细胞后,Arf6的表达量随着Vp2的增加而增加,并在感染后12 h出现显著差异（P＜0.05）且在24 h急剧上调（P＜0.001）。（4）ARF6的蛋白质水平变化与转录水平趋势一致。2.ARF6对IBDV复制的影响为探究ARF6对IBDV复制的影响,本实验构建了ARF6真核表达载体p EGFP-ARF6和影响ARF6活性的两个点突变体即p EGFP-ARF6-T27N和p EGFP-ARF6-Q67L以及合成针对ARF6的特异性小干扰RNA（si RNA）,通过q RT-PCR、WB、TCID50测定及激光共聚焦技术研究ARF6表达水平的变化对IBDV-Vp2基因和VP3蛋白表达量及IBDV滴度的影响,结果表明:（1）过表达ARF6可显著促进IBDV复制,IBDV-Vp2基因及VP3蛋白的表达随ARF6表达量的增加而明显上调（P＜0.01）,且ARF6与IBDV之间存在剂量依赖性;（2）敲减ARF6能显著降低IBDV的复制,与对照组相比,降低内源性ARF6的表达后,IBDV-Vp2基因及VP3蛋白的表达显著降低（P＜0.05）,IBDV的滴度也显著下降（P＜0.01）;（3）激光共聚焦显微镜显示,活性增强的p EGFP-ARF6-Q67L和野生型ARF6在DF-1细胞内呈聚集性点状分布,而活性降低的p EGFP-ARF6-T27N则呈现弥散性分布;（4）与野生型ARF6相比,p EGFP-ARF6-T27N能显著降低Vp2和VP3的表达（P＜0.01）,同时也显著降低IBDV的滴度（P＜0.05）。3.ARF6促进IBDV复制的机制初探根据以上结果证实ARF6能够促进IBDV的复制,因此我们尝试进一步探究其机制。结合ARF6的功能,利用激光共聚焦技术、q RT-PCR、WB、CCK-8试剂盒检测化合物pitstop 2对细胞活力的影响等方法进行探究,结果显示:（1）ARF6与膜相关细胞器线粒体（mitochondria,Mito）、内质网（endoplasmic reticulum,ER）和高尔基体（Golgi）存在共定位;（2）在IBDV早期进入细胞阶段,同对照组（仅感染IBDV）相比,过表达ARF6后,Vp2的表达水平均显著上调（P＜0.05）;而敲减ARF6后,Vp2的表达量明显下调（P＜0.05）;（3）使用靶向网格蛋白抑制剂pitstop 2,Vp2基因和VP3蛋白的表达水平显著下调（P＜0.01）;（4）在过表达ARF6并添加pitstop 2的处理下,与对照组相比,IBDV-Vp2基因和VP3蛋白表达也并未增加。4.IFITM3对IBDV复制的影响本实验将IBDV分别感染雏鸡和DF-1细胞,并利用过表达及敲减方法,收集感染后不同时间的样品,通过q RT-PCR检测Vp2和Ifitm3的表达水平变化。结果显示:（1）IBDV感染法氏囊后,Ifitm3表达在24 h出现显著上调（P＜0.05）并在72 h达到峰值,尽管之后有所下降,但仍显著高于正常水平;（2）与对照组相比,IBDV感染DF-1细胞后,Ifitm3的表达量在感染后24 h急剧上调,并显著高于对照组（P＜0.05）;（3）过表达IFITM3能够显著下调Vp2的表达;（4）敲减IFITM3则使Vp2的表达水平显著增加（P＜0.05）。以上结果表明IBDV感染能引起ARF6表达的上调;ARF6能促进IBDV的复制,且T27N位点在这个过程中可能有重要作用;另外ARF6可能通过网格蛋白影响IBDV早期进入细胞的过程从而促进IBDV的复制,而添加网格蛋白抑制剂后,能有效阻断这一过程。因此,本研究证实了ARF6对IBDV感染的影响,并对其机制进行了初步探讨;另一方面,本研究结果显示IFITM3能够显著减弱IBDV的复制。