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第一部分R-spondin/Wnt信号网络基因的遗传变异与骨质疏松患病风险的关联
目的：探讨R-spondin/Wnt信号通路基因的遗传变异与原发性骨质疏松患病风险之间的关联，筛选与骨质疏松相关的基因和位点。
方法：本部分选取武汉市的中老年人作为研究对象，最终纳入符合要求的研究对象1168例。通过二代测序技术在400例绝经女性中对R-spondin/Wnt信号通路的15个关键基因(RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、LGR4、LGR5、LGR6、LRP5、LRP6、FZD1、FZD4、WNT3A、WNT4、WNT10B、WNT11)进行目的区域测序。使用序列核关联检验(Sequence Kernel Association Test，SKAT)和外对照关联检验(Proxy External Controls Association Test，ProxECAT)等方法进行感兴趣区域(Region Of Interest，ROI)和基因水平的分析；通过多元线性回归、Logistic回归和Fisher精确检验等方法进行单核苷酸位点变异(Single Nucleotide Variants，SNVs)分析。针对罕见变异，同时采用GnomAD数据库东亚人群作为外对照进行基因和SNVs水平的分析。使用SNPscan技术在768例中老年人中验证测序阶段筛选出的阳性位点。使用骨折风险评估系统预测10年骨质疏松和髋骨骨折风险。
结果：测序阶段纳入228例骨质疏松病例和172例对照，发现R-spondin/Wnt信号通路上低频和罕见变异组成的ROI与骨质疏松患病风险和10年髋骨骨折预测风险显著关联(P＜0.05)。在基因水平，LGR6基因与腰椎T值(P-FDR=0.045)、Z值(P-FDR=0.030)及骨质疏松患病风险(P-FDR=0.030)显著相关；LRP6基因与10年骨质疏松骨折(P-FDR=0.003)及髋骨骨折(P-FDR=5.13×10-6)预测风险显著关联；以GnomAD数据库东亚人群为外对照，ProxECAT检验发现LGR4基因与骨质疏松患病风险显著相关(Pweighted=1.34×10-4；Pweighted–FDR=0.002)。在SNVs水平，携带rs10920362CT/TT基因型的个体比携带CC基因型的个体骨质疏松患病风险显著增加(OR=2.01，95%CI=1.23-3.29，P=5.3×10-3)；加性模型中，随着rs11178860危险等位基因A的增加，股骨颈骨密度(Bone Mineral Density，BMD)(β=-0.02，P=9.6×10-4)、T值(β=-0.18，P=8.6×10-3)和Z值(β=-0.15，P=0.027)显著降低；罕见变异rs750193863CT基因型与腰椎BMD(β=0.52，P=5.02×10-6)、T值(β=4.31，P=6.39×10-6)和Z值(β=4.42，P=2.16×10-6)的升高显著相关；以GnomAD数据库东亚人群为外对照，Fisher精确检验发现罕见非同义突变rs201256460与骨质疏松患病风险相关(OR=3.92，95%CI=1.41-10.96，P=0.023)。
验证阶段纳入356例骨质疏松病例和412例对照，成功验证了rs10920362(OR=2.04，95%CI=1.48-2.81，P-FDR=1.36×10-4)和rs11178860(OR=1.75，95%CI=1.25-2.46，P-FDR=6.33×10-3)与骨质疏松患病风险之间的关联；以GnomAD数据库东亚人群为外对照，验证了rs201256460与骨质疏松之间的关联(OR=4.40，95%CI=1.98-9.78，P-FDR=0.020)。
合并两部分数据发现rs10920362(OR=1.86，95%CI=1.44-2.41，P-FDR=2.50×10-5)和rs11178860(OR=1.97，95%CI=1.41-2.75，P-FDR=6.95×10-4)与骨质疏松患病风险之间存在显著关联；并发现随着rs750193863等位基因T的增加，BMD、T值和Z值均显著升高(P-FDR＜0.05)。
结论：R-spondin/Wnt信号通路、LGR6和LGR4基因与骨质疏松患病风险显著相关，LRP6基因与10年骨折预测风险相关。位于FZD4基因的罕见非同义突变rs201256460、LGR6基因的常见变异rs10920362和LGR5基因的常见变异rs11178860与BMD及骨质疏松患病风险有显著关联。
第二部分肠道菌群与骨质疏松患病风险的关联分析
目的：系统分析肠道菌群与原发性骨质疏松患病风险之间的关联，筛选与骨质疏松相关联的菌群。
方法：通过16SrRNA扩增子测序技术对180例中老年人粪便样本进行测序。采用Alpha多样性分析、Beta多样性分析、非参数检验、Spearman相关、岭回归模型和KEGG通路富集分析等方法，在门、科、属三个水平上对菌群数据进行分析。
结果：本部分共纳入77例骨质疏松病例和103例对照。180例粪便样本中共检测到1699种可操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，其中，病例组中1288种，对照组中1556种。病例组在各分类水平的菌群种类均少于对照组。病例组的Alpha多样性指数Observed_species、Chao和ACE均明显低于对照组。Beta多样性分析发现病例组和对照组菌群组成存在显著差异(F=3.413，P=1.00×10-4)。门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)在病例组的相对丰度低于对照组，与BMD、T值和Z值呈正相关；拟杆菌门(Bacteroidetes)在病例组的相对丰度高于对照组，与BMD、T值和Z值呈负相关。科水平上，病例组毛螺菌科(Lachnospiraceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)和乳杆菌科(Lactobacillaceae)的相对丰度低于对照组，与BMD、T值和Z值呈正相关；病例组拟杆菌科(Bacteroidaceae)的相对丰度高于对照组，BMD、T值和Z值随着Bacteroidaceae相对丰度的增加而减少。属水平上，病例组布劳特氏菌属(Blautia)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度低于对照组，与BMD、T值或Z值呈正相关；病例组拟杆菌属(Bacteroides)和副拟杆菌属(Parabacteroides )的相对丰度高于对照组，股骨颈BMD和髋关节T值随着Bacteroides相对丰度的增加而减少。85条KEGG代谢通路在病例组和对照组之间存在显著差异。其中，55条(64.7%)在病例组中富集，主要包括脂多糖生物合成、脂多糖生物合成蛋白和鞘脂类代谢等通路；30条(35.3%)在对照组中富集，主要包括信号转导、转运蛋白和核糖体生物合成等通路。
结论：骨质疏松病例组物种丰富度低于对照组。门水平菌群(Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria)、科水平菌群(Lachnospiraceae、Bifidobacteriaceae、Lactobacillaceae)和属水平菌群(Blautia、Bifidobacterium、Lactobacillus)的相对丰度与BMD、T值和Z值呈正相关，与骨质疏松患病风险呈负相关；菌群Bacteroidetes、Bacteroidaceae、Bacteroides、Parabacteroides与BMD、T值和Z值呈负相关，与骨质疏松患病风险呈正相关。研究结果表明肠道菌群与原发性骨质疏松患病风险之间存在显著关联。
第三部分R-spondin/Wnt信号网络基因通过肠道菌群影响骨质疏松患病风险探讨
目的：深入分析R-spondin/Wnt信号网络基因位点多态性与肠道菌群组成和结构之间的关联，探讨R-spondin/Wnt信号网络基因多态性是否通过改变肠道菌群组成和结构影响骨质疏松的患病风险。
方法：将与骨质疏松患病风险相关的高频阳性位点rs11178860和rs10920362的基因型作为分组，分析门、科和属三个水平菌群在各组的差异。结合Spearman相关分析和广义线性回归模型等统计方法，筛选与rs10920362或rs11178860关联的菌群。对比与骨质疏松患病风险有关联的菌群，筛选出既与骨质疏松患病风险关联，又与rs10920362或rs11178860关联的重叠菌群。
结果：本部分共纳入53例骨质疏松病例和60例对照。研究发现rs10920362CC基因型个体特有的OTU种类(348)多于CT/TT基因型个体(200)；rs11178860GG基因型个体特有的OTU种类(88)少于GA/AA基因型个体(569)。以rs10920362基因型为分组，CT/TT基因型个体中Actinobacteria、Bifidobacteriaceae和Bifidobacterium的相对丰度明显低于CC基因型个体。以rs11178860基因型为分组，未发现丰度有显著差异的菌群。校正性别、年龄、身体质量指数(Body Mass Inde x， BMI )、吸烟和饮酒的广义线性模型发现：rs10920362CT/TT基因型与菌群Actinobacteria(β=-1.47，P=1.47×10-12)、Bifidobacteriaceae(β=-1.83，P＜0.0001)和Bifidobacterium(β=-1.83，P＜0.0001)相对丰度的降低显著相关。对比发现，菌群Actinobacteria、Bifidobacteriaceae和Bifidobacterium的相对丰度既与骨质疏松患病风险相关，又与rs10920362多态性显著相关。
结论：本研究首次发现，rs10920362CT/TT基因型与菌群Actinobacteria、Bifidobacteriaceae和Bifidobacterium相对丰度的降低显著相关；Actinobacteria、Bifidobacterium和Bifidobacteriaceae的相对丰度既与骨质疏松患病风险相关，又与rs10920362多态性显著相关。宿主基因rs10920362CT/TT基因型可能通过减少菌群Actinobacteria、Bifidobacteriaceae和Bifidobacterium的相对丰度增加骨质疏松患病风险。宿主基因和肠道菌群相互作用的探索，可以为难治性骨质疏松的防治提供新的思路。
目的：探讨R-spondin/Wnt信号通路基因的遗传变异与原发性骨质疏松患病风险之间的关联，筛选与骨质疏松相关的基因和位点。
方法：本部分选取武汉市的中老年人作为研究对象，最终纳入符合要求的研究对象1168例。通过二代测序技术在400例绝经女性中对R-spondin/Wnt信号通路的15个关键基因(RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、LGR4、LGR5、LGR6、LRP5、LRP6、FZD1、FZD4、WNT3A、WNT4、WNT10B、WNT11)进行目的区域测序。使用序列核关联检验(Sequence Kernel Association Test，SKAT)和外对照关联检验(Proxy External Controls Association Test，ProxECAT)等方法进行感兴趣区域(Region Of Interest，ROI)和基因水平的分析；通过多元线性回归、Logistic回归和Fisher精确检验等方法进行单核苷酸位点变异(Single Nucleotide Variants，SNVs)分析。针对罕见变异，同时采用GnomAD数据库东亚人群作为外对照进行基因和SNVs水平的分析。使用SNPscan技术在768例中老年人中验证测序阶段筛选出的阳性位点。使用骨折风险评估系统预测10年骨质疏松和髋骨骨折风险。
结果：测序阶段纳入228例骨质疏松病例和172例对照，发现R-spondin/Wnt信号通路上低频和罕见变异组成的ROI与骨质疏松患病风险和10年髋骨骨折预测风险显著关联(P＜0.05)。在基因水平，LGR6基因与腰椎T值(P-FDR=0.045)、Z值(P-FDR=0.030)及骨质疏松患病风险(P-FDR=0.030)显著相关；LRP6基因与10年骨质疏松骨折(P-FDR=0.003)及髋骨骨折(P-FDR=5.13×10-6)预测风险显著关联；以GnomAD数据库东亚人群为外对照，ProxECAT检验发现LGR4基因与骨质疏松患病风险显著相关(Pweighted=1.34×10-4；Pweighted–FDR=0.002)。在SNVs水平，携带rs10920362CT/TT基因型的个体比携带CC基因型的个体骨质疏松患病风险显著增加(OR=2.01，95%CI=1.23-3.29，P=5.3×10-3)；加性模型中，随着rs11178860危险等位基因A的增加，股骨颈骨密度(Bone Mineral Density，BMD)(β=-0.02，P=9.6×10-4)、T值(β=-0.18，P=8.6×10-3)和Z值(β=-0.15，P=0.027)显著降低；罕见变异rs750193863CT基因型与腰椎BMD(β=0.52，P=5.02×10-6)、T值(β=4.31，P=6.39×10-6)和Z值(β=4.42，P=2.16×10-6)的升高显著相关；以GnomAD数据库东亚人群为外对照，Fisher精确检验发现罕见非同义突变rs201256460与骨质疏松患病风险相关(OR=3.92，95%CI=1.41-10.96，P=0.023)。
验证阶段纳入356例骨质疏松病例和412例对照，成功验证了rs10920362(OR=2.04，95%CI=1.48-2.81，P-FDR=1.36×10-4)和rs11178860(OR=1.75，95%CI=1.25-2.46，P-FDR=6.33×10-3)与骨质疏松患病风险之间的关联；以GnomAD数据库东亚人群为外对照，验证了rs201256460与骨质疏松之间的关联(OR=4.40，95%CI=1.98-9.78，P-FDR=0.020)。
合并两部分数据发现rs10920362(OR=1.86，95%CI=1.44-2.41，P-FDR=2.50×10-5)和rs11178860(OR=1.97，95%CI=1.41-2.75，P-FDR=6.95×10-4)与骨质疏松患病风险之间存在显著关联；并发现随着rs750193863等位基因T的增加，BMD、T值和Z值均显著升高(P-FDR＜0.05)。
结论：R-spondin/Wnt信号通路、LGR6和LGR4基因与骨质疏松患病风险显著相关，LRP6基因与10年骨折预测风险相关。位于FZD4基因的罕见非同义突变rs201256460、LGR6基因的常见变异rs10920362和LGR5基因的常见变异rs11178860与BMD及骨质疏松患病风险有显著关联。
第二部分肠道菌群与骨质疏松患病风险的关联分析
目的：系统分析肠道菌群与原发性骨质疏松患病风险之间的关联，筛选与骨质疏松相关联的菌群。
方法：通过16SrRNA扩增子测序技术对180例中老年人粪便样本进行测序。采用Alpha多样性分析、Beta多样性分析、非参数检验、Spearman相关、岭回归模型和KEGG通路富集分析等方法，在门、科、属三个水平上对菌群数据进行分析。
结果：本部分共纳入77例骨质疏松病例和103例对照。180例粪便样本中共检测到1699种可操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，其中，病例组中1288种，对照组中1556种。病例组在各分类水平的菌群种类均少于对照组。病例组的Alpha多样性指数Observed_species、Chao和ACE均明显低于对照组。Beta多样性分析发现病例组和对照组菌群组成存在显著差异(F=3.413，P=1.00×10-4)。门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)在病例组的相对丰度低于对照组，与BMD、T值和Z值呈正相关；拟杆菌门(Bacteroidetes)在病例组的相对丰度高于对照组，与BMD、T值和Z值呈负相关。科水平上，病例组毛螺菌科(Lachnospiraceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)和乳杆菌科(Lactobacillaceae)的相对丰度低于对照组，与BMD、T值和Z值呈正相关；病例组拟杆菌科(Bacteroidaceae)的相对丰度高于对照组，BMD、T值和Z值随着Bacteroidaceae相对丰度的增加而减少。属水平上，病例组布劳特氏菌属(Blautia)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度低于对照组，与BMD、T值或Z值呈正相关；病例组拟杆菌属(Bacteroides)和副拟杆菌属(Parabacteroides )的相对丰度高于对照组，股骨颈BMD和髋关节T值随着Bacteroides相对丰度的增加而减少。85条KEGG代谢通路在病例组和对照组之间存在显著差异。其中，55条(64.7%)在病例组中富集，主要包括脂多糖生物合成、脂多糖生物合成蛋白和鞘脂类代谢等通路；30条(35.3%)在对照组中富集，主要包括信号转导、转运蛋白和核糖体生物合成等通路。
结论：骨质疏松病例组物种丰富度低于对照组。门水平菌群(Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria)、科水平菌群(Lachnospiraceae、Bifidobacteriaceae、Lactobacillaceae)和属水平菌群(Blautia、Bifidobacterium、Lactobacillus)的相对丰度与BMD、T值和Z值呈正相关，与骨质疏松患病风险呈负相关；菌群Bacteroidetes、Bacteroidaceae、Bacteroides、Parabacteroides与BMD、T值和Z值呈负相关，与骨质疏松患病风险呈正相关。研究结果表明肠道菌群与原发性骨质疏松患病风险之间存在显著关联。
第三部分R-spondin/Wnt信号网络基因通过肠道菌群影响骨质疏松患病风险探讨
目的：深入分析R-spondin/Wnt信号网络基因位点多态性与肠道菌群组成和结构之间的关联，探讨R-spondin/Wnt信号网络基因多态性是否通过改变肠道菌群组成和结构影响骨质疏松的患病风险。
方法：将与骨质疏松患病风险相关的高频阳性位点rs11178860和rs10920362的基因型作为分组，分析门、科和属三个水平菌群在各组的差异。结合Spearman相关分析和广义线性回归模型等统计方法，筛选与rs10920362或rs11178860关联的菌群。对比与骨质疏松患病风险有关联的菌群，筛选出既与骨质疏松患病风险关联，又与rs10920362或rs11178860关联的重叠菌群。
结果：本部分共纳入53例骨质疏松病例和60例对照。研究发现rs10920362CC基因型个体特有的OTU种类(348)多于CT/TT基因型个体(200)；rs11178860GG基因型个体特有的OTU种类(88)少于GA/AA基因型个体(569)。以rs10920362基因型为分组，CT/TT基因型个体中Actinobacteria、Bifidobacteriaceae和Bifidobacterium的相对丰度明显低于CC基因型个体。以rs11178860基因型为分组，未发现丰度有显著差异的菌群。校正性别、年龄、身体质量指数(Body Mass Inde x， BMI )、吸烟和饮酒的广义线性模型发现：rs10920362CT/TT基因型与菌群Actinobacteria(β=-1.47，P=1.47×10-12)、Bifidobacteriaceae(β=-1.83，P＜0.0001)和Bifidobacterium(β=-1.83，P＜0.0001)相对丰度的降低显著相关。对比发现，菌群Actinobacteria、Bifidobacteriaceae和Bifidobacterium的相对丰度既与骨质疏松患病风险相关，又与rs10920362多态性显著相关。
结论：本研究首次发现，rs10920362CT/TT基因型与菌群Actinobacteria、Bifidobacteriaceae和Bifidobacterium相对丰度的降低显著相关；Actinobacteria、Bifidobacterium和Bifidobacteriaceae的相对丰度既与骨质疏松患病风险相关，又与rs10920362多态性显著相关。宿主基因rs10920362CT/TT基因型可能通过减少菌群Actinobacteria、Bifidobacteriaceae和Bifidobacterium的相对丰度增加骨质疏松患病风险。宿主基因和肠道菌群相互作用的探索，可以为难治性骨质疏松的防治提供新的思路。