自然界中的微生物在复杂的生存环境中进化形成了多种蛋白分泌系统来转运毒力因子即效应蛋白,从而更好地应对生存挑战达到适应环境的目的。可收缩注射系统（Contractile injection systems,CISs）作为一种重要的蛋白分泌系统,广泛存在于细菌和古细菌中,是细菌对抗竞争者细胞或宿主细胞的强有力武器,对细菌在毒力和环境适应方面具有重要作用。发光杆菌毒力基因簇PVC（Photorhabdus Virulence Cassette）是典型的细胞外 CISs（Extracellular CISs,eCISs）,以类似噬菌体尾部的结构发挥分子注射器的作用,将其效应蛋白注射至宿主细胞内,在发光杆菌致病性中扮演了十分重要的角色。本研究选取非共生发光杆菌（Photorhabdus asymbiotica,Pa）的PVC装置作为研究对象,一方面鉴定PVC效应蛋白的功能,另一方面揭示PVC对效应蛋白的识别过程,从而深入理解Pa的致病机制,为PVC领域的研究补充新的内容。本研究中,我们首先探索了 Pa的PVC效应蛋白Pdp1（Photorhabdus dNTP pyrophosphatase 1）和 Pnf（Photorhabdus necrosis factor）的功能。生物信息学预测显示Pdp1含有具有dNTP焦磷酸酶活性的PRK02491结构域,我们通过镍柱亲和层析法纯化了 Pdp1及其保守残基位点突变体的蛋白溶液,焦磷酸酶活性检测证实了Pdp1具有dNTP焦磷酸酶活性并确定了其活性位点。我们通过镜下观察和细胞染色方法观察到Pnf在PVC的转运下使细胞肌动蛋白骨架异常,产生了细胞毒性。因此,Pdp1和Pnf分别通过破坏宿主细胞dNTP稳态和抑制细胞肌动蛋白骨架的形成对真核细胞产生毒性。随后,通过序列比对和质谱分析我们发现了 PVC效应蛋白Pdp1和Pnf内N端信号肽（Signal Peptide,SP）的存在,SP在效应蛋白的识别、装载和稳定过程中具有关键作用。将SP分别融合到报告蛋白、细菌效应蛋白及真核来源蛋白N端,通过Western blot验证了 PVC对这些蛋白的识别和装载,并且通过细胞学实验如细胞活性检测、荧光强度检测和显微镜观察等方式证实了融合SP的蛋白能够被PVC转运至哺乳动物细胞并发挥毒性作用。最后,我们将SP融合到一种作用于真核细胞的毒素蛋白TcsT N端,该毒素蛋白已被证明具有抗肿瘤作用,我们通过细胞活性检测证实了 PVC对该毒素蛋白的转运和对小鼠肿瘤细胞J774A.1的毒性作用,为PVC装置在药物输送及肿瘤治疗方面的应用提供了依据和可能性。另外,PVC溶液能够实现体外的提取和纯化,并且我们的结果也表明PVC本身细胞毒性极低,这使得PVC成为理想的蛋白分泌系统体外研究模型。我们对N端信号肽的鉴定更加扩大了 PVC可装载并转运的蛋白种类和范围,显著提高了 PVC应用的广泛性、便利性和灵活性。即不用过多考虑蛋白质种类、大小、所带电荷及构象,通过简单融合SP便可利用PVC识别和转运相应蛋白,实现对细胞的攻击。PVC所能装载和转运的蛋白分子范围广泛,这种超越物种和蛋白本身属性限制的特点将把PVC的潜在应用引向更广的领域,比如利用N端信号肽与临床药物进行融合,探讨PVC对临床药物的装载和输送等。因此,我们期待PVC可作为一种分子注射器样的潜在蛋白递送工具,深入的研究可以为临床药物输送及精准治疗提供有价值的参考。