冠心病已成为危害人类健康的严重公共卫生问题和社会问题。中医药在改善冠心病患者症状和提高冠心病患者生活质量中发挥着重要的作用,其起效的核心在于辨证论治。其实质是对冠心病的患者进行分层,确定不同的亚型,再进行个体化的治疗,以达到最大限度的发挥药物的治疗作用和减少药物的不良反应。辨证论治的优势在于根据宏观的症状群,即可确定个体化的治疗方案；而其不足之处在于缺乏客观定量的生物学指标。在中医理论的指导下,流行病学显示血瘀证是冠心病的主要证候,寻找冠心病血瘀证相关的生物标志物,有助于对冠心病患者进行进一步分层,以指导临床治疗。microRNA (miRNA)是一类非编码小RNA分子,可以导致其靶基因的降解或阻碍其靶基因的翻译。miRNA的表达异常引起相应生物网络的紊乱是疾病发生的重要原因之一。新近研究显示miRNA的表达模式在诸多的心血管疾病中发生了变化,如动脉粥样硬化、高血压、心律失常、心肌梗死、心肌肥厚及心力衰竭。miRNA在冠心病中作为生物标志物和治疗靶点已经开展了广泛的研究。miRNA与冠心病密切相关,但目前仍未有探索miRNA作为冠心病血瘀证生物标志物的研究。将miRNA引入冠心病血瘀证生物标志物的研究,为寻找冠心病血瘀证生物标志物提供了新的思路。本课题采用系统生物学的方法寻找不稳定性心绞痛血瘀证的生物标志物,探索其发生机制,期望能为不稳定性心绞痛血瘀证的诊断提供新的生物标志物,同时为其治疗提供新的靶点。1目的检测不稳定性心绞痛血瘀证患者,不稳定性心绞痛痰浊证患者,急性缺血性中风血瘀证患者和健康对照者的microRNA表达谱和基因表达谱,寻找起关键调控作用的差异表达的miRNA和基因,确定各组能够作为生物标志物的rniRNA及其靶基因,对各组的生物标志物的表达模式进行验证。探索miRNA及其靶基因作为不稳定性心绞痛血瘀证的生物标志物的可行性,为不稳定性心绞痛患者的临床分层提供依据。2研究方法2.1外周血单核细胞(PBMC)的分离和总RNA的提取选取符合西医疾病诊断标准和中医证侯诊断标准的患者,分为4组,包括不稳定性心绞痛血瘀证患者、不稳定性心绞痛痰浊证患者、急性缺血性中风血瘀证患者和健康对照者。每组纳入20例,抽取外周血,分离PBMC,提取总RNA。采用紫外吸收法检测总RNA的纯度和浓度,变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。2.2外周血单核细胞的microRNA和基因的表达谱检测每组取5例病例的PBMC的总RNA用于microRNA芯片和基因芯片检测。采用Phalanx公司生产的Human miRNA OneArray? v4芯片和Human Whole Genome OneArray? v5芯片进行检测。2.3microRNA和基因的表达谱的生物信息学整合分析根据各组与正常组的比值的对数值和P值进行差异表达的microRNA和基因的筛选。运用聚类软件Cluster3.0进行average-linkage层次聚类运算。根据聚类结果,运用Java TreeView-1.1.6r2绘制热图。采用在线分析软件DAVID6.7进行差异基因富集的KEGG通路分析。基于microRNA对靶基因的负向性调控,根据不同组中的差异表达的]microRNA的情况,采取不同的整合通路和网络分析方法。运用miRTrail构建microRNA和靶基因相互作用网络。运用网络分析和可视化软件BiNA生成nicroRNA和靶基因相互作用网络图。2.4qRT-PCR验证根据各组差异表达的microRNA和基因的通路和网络分析结果,确定各组中起关键调控作用的microRNA及其靶基因。每组中除用于microRNA芯片和基因芯片检测的5例标本外,剩余的15例标本用于qRT-PCR验证各组中起关键调控作用的microRNA及其靶基因的表达模式。2.5统计学方法计量资料用均数±标准差表示。样本量小于50采Shapiro-Wilk检验判断是否符合正态分布,样本量大于50采用Kolmogorov-Smirnov检验判断是否符合正态分布。两组间计量资料比较时,不符合正态分布的组采用Mann-Whitney秩和检验；符合正态分布的,采用Levene’s检验判断方差是否具有齐性,方差齐的组采用独立样本的t检验(unpaired Student’s t test);方差不齐的组采用近似t检验(approximate Student’s t test)。多组间计量资料比较时,不符合正态分布的组采用Kruskal-Wallis秩和检验；符合正态分布的,采用Levene’s检验判断方差足否具有齐性,方差齐的组采用单因素方差分析(one-way ANOVA);方差不齐的组采用Kruskal-Wallis秩和检验。计数资料进行卡方检验,但足若行×列表格中有1/5以上的格子理论频数<5,或有一个格子理论频数<1则采用似然比卡方的结果。采用SPSS16.0统计软件分析数据,P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism5软件根据统计结果绘制柱状图和盒状图。3结果3.1一般临床资料对不稳定性心绞痛血瘀证组、不稳定性心绞痛痰浊证组、急性缺血性中风血瘀证组和健康对照组的一般临床资料进行了统计分析,发现4组用于nicroRNA芯片和基因芯片检测的年龄、性别、BMI、吸烟史、2型糖尿病、CHO、LDL、 HDL、TG和CRP方面比较均无显著性差异(P>0.05)。4组用于qRT-PCR验证的年龄、性别、BMI、吸烟史、2型糖尿病、CHO、LDL、HDL和CRP比较均无显著性差异(P>0.05)。3.2外周血单核细胞的microRNA和基因的表达谱检测在microRNA表达谱中,不稳定性心绞痛血瘀证组和健康对照组相比,25个microRNA的表达存在差异,其中23个microRNA上调,2个microRNA下调；不稳定性心绞痛痰浊证组和健康对照组相比,11个microRNA的表达存在差异,其中2个microRNA上调,9个microRNA下调；急性缺血性中风血瘀证组和健康对照组相比,20个microRNA的表达上调,无microRNA下调。各组差异表达的microRNA见表7。在基因表达谱中,不稳定性心绞痛血瘀证组和健康对照组相比,1081个基因的表达存在差异,其中673个基因上调,408个基因下调；不稳定性心绞痛痰浊证组和健康对照组相比,697个基因的表达存在差异,其中451个基因上调,246个基因下调；急性缺血性中风血瘀证组和健康对照组相比,546个基因的表达存在差异,其中383个基因上调,163个基因下调。3.3microRNA和基因表达谱的生物信息学分析各组差异表达的基因的聚类分析产生的热图结果显示,每组的5个样本聚为一类,显示各组组内的样本一致性较好。各组与健康对照组相比,1nicroRNA和基因的表达差异显著,可以通过microRNA和基因的表达差异将各组与健康对照组区分开。DAVID软件分析各组差异表达的基因富集的KEGG通路的结果如下：在不稳定性心绞痛血瘀证组上调的基因富集的7条通路中,NOD样受体信号通路、凋亡通路和细胞因子和受体相互作用通路与不稳定性心绞痛密切相关。不稳定性心绞痛血瘀证组下调的基因富集的6条通路中,抗原呈递和处理通路和p53信号通路与不稳定性心绞痛密切相关。不稳定性心绞痛痰浊证组下调的基因富集的7条通路中,抗原呈递和处理通路和NK细胞介导的细胞毒性作用通路与不稳定性心绞痛密切相关。不稳定性心绞痛痰浊证组上调的基因富集的6条通路中,MAPK信号通路、NOD样受体信号通路和趋化因子信号通路与不稳定性心绞痛密切相关。急性缺血性中风血瘀证组上调的基因富集的3条通路中,NOD样受体信号通路和MAPK信号通路与急性缺血性中风密切相关。急性缺血性中风血瘀证组下调的基因富集的3条通路中,NK细胞介导的细胞毒性作用通路和细胞因子和受体相互作用通路与急性缺血性中风密切相关。在miRTrail构建的microRNA和靶基因相互作用网络中,6个上调的microRNA和115个下调的靶基因构成了不稳定性心绞痛血瘀证的网络,1个下调的microRNA和10个上调的靶基因构成了不稳定性心绞痛痰浊证的网络,5个上调的microRNA和24个实际下调的靶基因构成了急性缺血性中风血瘀证的网络。3.4qRT-PCR验证和健康对照组相比,miR-146b-5p、miR-199a-3p和miR-199a-5p在不稳定性心绞痛血瘀证组和急性缺血性中风血瘀证组中表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),在不稳定性心绞痛痰浊证组中无明显变化；miR-146b-5p、miR-199a-3p和miR-199a-5p在不稳定性心绞痛血瘀证组和急性缺血性中风血瘀证组之间相比,表达无差异;miR-363a-5p和miR-668在不稳定性心绞痛痰浊证组中表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),在不稳定性心绞痛血瘀证组和急性缺血性中风血瘀证组中无明显变化。和健康对照组相比,CALR在不稳定性心绞痛血瘀证组中表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),在不稳定性心绞痛痰浊证组和急性缺血性中风血瘀证组中无明显变化；TP53在不稳定性心绞痛血瘀证组和急性缺血性中风血瘀证组中表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),在不稳定性心绞痛痰浊证组中无明显变化；RIPK2在三组之中表达都升高,差异有统计学意义(P<0.05)；RIPK2在三组之间相比,表达无差异；STK4在不稳定性心绞痛血瘀证组和不稳定性心绞痛痰浊证组中表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),在急性缺血性中风血瘀证组中无明显变化；STK4在不稳定性心绞痛血瘀证组和不稳定性心绞痛痰浊证组之间相比,表达无差异；IL2RB在不稳定性心绞痛血瘀证组和急性缺血性中风血瘀证组中表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),在不稳定性心绞痛痰浊证组中无明显变化；IL2RB在不稳定性心绞痛血瘀证组和急性缺血.性中风血瘀证组之间相比,表达无差异；FASLG在急性缺血性中风血瘀证和不稳定性心绞痛痰浊证组中表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),在不稳定性心绞痛血瘀证组中无明显变化；FASLG在急性缺血性中风血瘀证和不稳定性心绞痛痰浊证组之间相比,表达无差异。4结论4.1microRNA芯片检测发现,与健康对照者相比,不稳定性心绞痛血瘀证、不稳定性心绞痛痰浊证和急性缺血性中风血瘀证的microRNA表达谱存在差异。4.2基于通路和网络相结合的生物信息学分析发现各组中具有关键调控作用的microRNA和靶基因如下：在不稳定性心绞痛血瘀证中,上调的miR-146b-5p和miR-199a-5p可能通过下调CALR和TP53以减轻炎症和凋亡；在不稳定性心绞痛痰浊证中,下调的miR-363-5p和miR-668可能通过上调RIPK2和STK4以促进炎症和凋亡;在急性缺血性中风血瘀证中,上调的miR-146b-5p和miR-199a-3p可能通过下调IL2RB和FASLG以减轻炎症和凋亡。4.3qRT-PCR验证证实了各种证候中具有关键调控作用的microRNA和靶基因的表达模式,其结果提示：miR-146b-5p、miR-199a-5p、CALR和TP53可以作为不稳定性心绞痛血瘀证患者的生物标志物,miR-363-5p、miR-668、RIPK2和STK4可以作为不稳定性心绞痛痰浊证患者的生物标志物,miR-146b-5p、miR-199a-3p、 IL2RB和FASLG可以作为急性缺血性中风血瘀证患者的生物标志物。4.4在不稳定性心绞痛中,血瘀证患者的1niR-146b-5p和miR-199a-5p表达上调,而CALR和TP53表达下调；痰浊证患者的miR-363-5p和miR-668表达上调,而RIPK2和STK4表达下调。这表明“同病异证”在microRNA及其靶基因表达层面具有其生物学基础。4.5在不稳定性心绞痛血瘀证和急性缺血性中风血瘀证中,miR-146b-5p、 miR-199a-3p和miR-199a-5p都表达上调,而TP53和IL2RB都表达下调。这表明“异病同证”在microRNA及其靶基因表达层面具有其生物学基础。4.6不稳定性心绞痛血瘀证和急性缺血性中风血瘀证在差异表达的rnicroRNA和靶基因方面具有相似性,不同之处在于调控的关键靶基因仍有差异。从microRNA及其靶基因表达层面分析“异病同证”由于其病变部位的不同,仍然存在差异性。