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背景:糖尿病性骨质疏松症(Diabetic osteoporosis,DOP)是由糖尿病并发骨质疏松导致的骨量减少,是糖尿病累及骨骼出现的严重并发症,该病严重影响着糖尿病患者的生存质量,二者之间的关系目前尚不明晰,如何能够有效地控制及治疗DOP已成为众多医务工作者和科研人员探讨的焦点及研究的课题。二甲双胍(Metformin,MF)是治疗2型糖尿病患者的一线用药,其在肿瘤、抗衰老、甲状腺疾病、骨质疏松症等领域的研究应用越来越受到重视。绝经期妇女雌激素缺乏会导致绝经后骨质疏松症,雌激素通过抑制破骨细胞的分化、成熟,促进成骨细胞的增殖、分化,从而对骨形成发挥保护作用。近年来研究发现MF除了发挥降糖作用以外,还表现出明显的成骨作用,MF的成骨作用涉及到多种细胞分子机制。一方面骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein,BMP-2)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是成骨细胞分化、成熟的重要的因子,MF可通过激活磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)代谢途径,增强BMP-2和OPN的表达和分泌,同时MF诱导AMPK信号通路激活可以增强核转录因子转录受体相关转录因子2(Runt-Related transcription factor-2,Runx2)的表达,在成骨细胞中小异二聚体伴侣蛋白(Small Heterodimer Partner,SHP)与Runx2形成复合物调节成骨细胞相关靶基因表达,最终诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞方向分化,促进成骨细胞的增值、分化成熟及基质矿化,增强成骨细胞的骨形成;另一方面MF能够刺激骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)的合成与分泌,降低NFκB受体的配体(ligand of receptor activate of nuclear factor kappa,RANKL)在成骨细胞中的表达,OPG是抑制骨吸收的关键因子,通过竞争性和RANKL结合进而阻碍RANKL与RANK的结合,抑制破骨细胞活性并促进其凋亡,减弱骨吸收,发挥成骨效应。目的:本研究以雌二醇为对照组,观察MF对去卵巢大鼠骨密度(Bone mineral density,BMD)及骨矿含量的影响,同时从细胞水平及分子生物学水平探讨MF对去卵巢大鼠BMSCs向成骨细胞分化的影响,探讨MF发挥骨保护作用可能的机制,为MF临床防治糖尿病性骨质疏松症的合理用药提供科学的实验理论依据。方法:研究1:雌激素与MF对去卵巢大鼠BMD以及骨矿含量的影响3月龄SD(Sprangue-Dawley)雌性大鼠60只随机分成4组:假手术(Sham-operated group,SHAM)组、去卵巢(Ovariectomized,OVX)组、去卵巢+二甲双胍(Ovariectomized+Metformin,OVX+MF)组和去卵巢+雌二醇(Ovariectomized+β-estradiol,OVX+E2)组。去卵巢手术或假手术后1周,OVX+MF组按100mg·kg-1·d-1灌胃MF,OVX+E2组按0.1mg·kg-1·d-1灌胃17-β雌二醇,其它各组灌胃同等体积的蒸馏水,并按体重变化调整给药量。连续给药60天后引颈法处死大鼠,分离大鼠的股骨和胫骨,采用双能X线吸收测量法测定各组大鼠右侧胫骨BMD以及骨矿含量。研究2:雌激素与MF对去卵巢大鼠BMSCs向成骨细胞分化的影响2.1 BMSCs的分离和培养:从各组SD大鼠双侧股骨和胫骨取骨髓细胞悬液,分离培养大鼠BMSCs并诱导其向成骨细胞分化,用MTT法测定细胞活性及增殖能力。2.2碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定:各组细胞按照5×105个/孔的密度接种在6孔板内,添加适量成骨诱导液培养7天后,用PBS清洗细胞层,然后溶解0.5ml的0.1%Triton X-100中,按ALP试剂盒说明操作。2.3矿化结节形成和钙含量的测定:各组细胞按照5×105个/孔的密度依次接种在6孔板内,添加适量成骨诱导液培养28天。之后用茜素红S法染色,具体方法为:用PBS清洗培养皿2次,用95%的酒精进行原位固定,用1%的茜素红(由2%酒精配制,PH为进行8.3)染色。染色之后置于倒置显微镜下观察,借助用10mm的坐标网计数形成的钙化结节的数目。细胞培养层用0.6 N的盐酸脱钙24小时,含钙的上清液用o-甲酚酞络和酮法测定其中钙的含量。2.4 RNA提取以及Real-time PCR测定成骨细胞基因:各组细胞经接种、诱导培养之后,提取RNA,荧光定量实时PCR测定成骨细胞基因表达变化:Collagen type I、OC、OPG、RANKL、IL-6mRNA,GAPDH作为管家基因。确认Real-time PCR的扩增曲线和溶解曲线无误后,用双CT法进行PCR相对定量计算。结果:1.雌激素与MF对去卵巢大鼠BMD以及骨矿含量的影响,测定各组大鼠的BMD以及骨矿含量后分析得出:与SHAM组比较,OVX组的BMD以及骨矿含量显著降低(P<0.01)。各组分别给予MF与雌激素能够显著改善去卵巢大鼠的BMD以及骨矿含量(P<0.01),但OVX+E2组BMD以及骨矿含量高于OVX+MF组,统计学有差异(P<0.05)。OVX+MF组与OVX+E2组的BMD以及骨矿含量均接近对照组,无统计学差异(P>0.05)。2.MTT法实验结果提示,各组SD大鼠双侧股骨和胫骨分离、培养BMSCs,用矿化诱导液培养诱导BMSCs向成骨细胞方向分化,接种后在倒置显微镜下观察细胞生长变化。接种后1-3d内为细胞生长适应期,细胞增殖缓慢,第6d增殖速度达到高峰,之后逐渐减慢,细胞数量开始下降。在倒置相差显微镜下,传代的大鼠BMSCs加入诱导的培养基,经差速离心贴壁后呈小圆球形悬浮在培养液内,在2-3h内开始贴壁,接种3天后细胞呈梭形、纺锤型、多边形、三角形,并向外伸展出生长突,6-8天长满单层,部分细胞借突起相互连接,高密度区细胞逐步向成骨细胞形态转化;生长突相互连接融合成片,成骨细胞可呈多层重叠生长,并呈现钙化趋势,细胞基质分泌增多并包裹细胞,10-12天后出现较多散在的致密团块,并且逐渐增大,团块周边区域细胞密度较高,而且细胞轮廓模糊,团块中心区逐渐变暗,透光性差,形成明显的结节。荧光显微镜下观察各组BMSCs细胞形态变化,发现细胞培养3天后各组均出现成骨细胞的典型形态:多边形、三角形和梭形,在OVX组中可以看到明显增加的呈现红色荧光的死亡细胞,而在SHAM组中几乎看不到死亡细胞的存在;与OVX组比较,OVX+E2组与OVX+MF组中死亡细胞数目减少,细胞呈现融合趋势;说明MF能够促进BMSCs向成骨细胞分化,促进成骨细胞的活性,逆转细胞的死亡。去卵巢大鼠成骨细胞的细胞活性明显减弱,MF和雌激素均明显改善了去卵巢大鼠成骨细胞活性的抑制作用,二者相比雌激素的作用较强。3.各组大鼠BMSCs分化为成骨细胞后细胞增殖、碱性磷酸酶活性与钙沉积量的变化:与SHAM组比较,OVX组成骨细胞的增殖能力、ALP活性明显被抑制,钙沉积量明显减少(P<0.05)。与OVX组比较,在给予MF和雌二醇干预后,显著增强了去卵巢大鼠成骨细胞的增殖能力以及ALP活性,钙沉积量显著增加(均P<0.05);OVX+E2组成骨细胞增殖能力、ALP活性、钙沉积量高于OVX+MF组,差异显著,具有统计学意义(均P<0.05)。4.各组大鼠BMSCs分化为成骨细胞后矿化结节的形成:在矿化诱导液培养21天后,倒置显微镜下观察,SHAM组成骨细胞多层重叠生长逐渐形成小结节,随着胶原堆积和钙盐沉积,形成不透光的矿化结节细胞,钙化结节数量多,在钙化结节周围可观察到较多钙盐沉积;而在OVX组成骨细胞钙化明显受到抑制,细胞没有显著融合,没有看到显著的矿化结节。但在OVX+E2组与OVX+MF组中成骨细胞开始重叠生长并逐渐形成矿化结节,钙化结节数量较多,在钙化结节周围有较多钙盐沉积。MF和雌激素可以明显改善对去卵巢大鼠成骨细胞矿化的抑制作用,但雌激素的作用较强。5.各组大鼠成骨细胞的基因表达变化:与SHAM组比较,OVX组中I型胶原(Collagen type I)、骨钙素(Osteocalcin,OC)、骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)mRNA表达水平显著降低,而NFκB受体活化因子的配体(ligand of receptor activate of nuclear factor kappa,RANKL)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)mRNA表达显著增强,差异具有统计学意义(P<0.05);与OVX组相比较,OVX+E2组、OVX+MF组显著增加了Collagen type I、OC、OPG mRNA的表达水平,并且抑制了RANKL、IL-6 mRNA的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);进一步与SHAM组比较,OVX+MF组Collagen type I、OC、OPG、RANKL、IL-6 mRNA的表达水平均高于SHAM组,差异具有统计学意义(P<0.05);与OVX+E2组比较,OVX+MF组Collagen type I、OC、OPG mRNA表达水平低于OVX+E2组,RANKL、IL-6 mRNA的表达高于OVX+E2组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.去卵巢大鼠的BMD以及骨矿含量显著降低,雌激素和MF均可以显著增强去卵巢大鼠的BMD和骨矿含量,但MF略弱于雌激素。2.去卵巢大鼠成骨细胞的增殖活性、ALP活性以及钙化能力均显著降低,雌激素和MF均可以显著增加成骨细胞的增殖活性、ALP活性以及钙化能力,但MF略弱于雌激素。3.去卵巢大鼠的BMSCs向成骨细胞分化受到抑制,Collagen type I、OC、OPG表达水平显著受到抑制,RANKL、IL-6 mRNA水平显著增强,雌激素和MF均可以显著增加Collagen type I、OPG mRNA水平,RANKL、IL-6 mRNA水平显著受到抑制。MF可能通过OPG/RANKL/RANK细胞信号通路促进BMSCs向成骨细胞分化,抑制破骨细胞的活性。