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水稻胚乳是种子的主要贮藏组织,富含淀粉。淀粉的生物合成影响水稻籽粒的外观、粒重和淀粉特性,进而决定稻米的品质和用途,因此深入解析水稻胚乳淀粉合成调控网络具有重要的应用价值。粉质胚乳是一类因淀粉或蛋白合成积累异常而出现的不透明籽粒表型,是研究水稻胚乳发育和淀粉合成调控网络的理想材料。本研究以来自60Co辐射诱变的粳稻品种Kitaake突变体库中的粉质胚乳突变体m39为研究材料,分析了淀粉颗粒形态、胚乳组分和淀粉理化性质,并利用图位克隆和转基因互补技术克隆和鉴定 了目的基因PTST2(PROTEIN TARGETING TO STARCH2),进一步解析了PTST2调控胚乳发育与淀粉合成代谢的作用机制。研究结果如下:1、突变体m39的表型鉴定。突变体m39株高和小穗育性显著降低。成熟糙米呈现粉质不透明,粒长、粒宽、粒厚和千粒重显著下降,淀粉颗粒呈球形,颗粒间空隙较大且排列疏松。糙米总淀粉、表观直链淀粉含量和相对结晶度均显著降低,但支链淀粉长分支侧链含量降低。突变体淀粉的糊化温度和糊化热焓均显著低于野生型淀粉。突变体籽粒灌浆比野生型缓慢,半薄切片显示胚乳中积累大量小的、中空的和分散的异形复粒淀粉粒。突变体成熟花粉粒中淀粉颗粒积累减少,导致花粉粒败育。2、突变基因的定位与验证。对粉质胚乳性状进行遗传分析,发现突变性状受隐性单基因控制。利用图位克隆技术将突变基因定位在第3条染色体长臂上的InDel引物3-7和3-10之间,两个引物之间含有49.9 kb,包含6个开放阅读框。通过对野生型和突变体中6个开放阅读框的编码区分段扩增测序和序列比对,发现只有LOC_Os03g48170第8内含子末端的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代,单碱基替换导致第8内含子不能被剪接,突变体产生异常的转录本。将野生型中LOC_Os03g48170全长基因组序列通过农杆菌介导转入突变体愈伤中,阳性转基因株系的花粉育性和糙米表型得到恢复。序列分析显示LOC_Os03g48170编码PTST2蛋白,N端含有质体定位信号肽,C端含有一个CBM48结构域。3、PTST2组织表达和编码蛋白的亚细胞定位。PTST2的表达在水稻各个组织中均被检测到,其中叶和叶鞘中表达量最高,发育胚乳中持续高水平表达。烟草原生质体瞬时表达显示PTST2定位于叶绿体中,转基因水稻中PTST2定位在花粉粒和胚乳造粉体基质内。4、PTST2可以结合淀粉,突变后影响淀粉合成相关酶基因的表达。体外淀粉结合实验表明PTST2中的CBM48结构域可以与淀粉结合,其突变不能结合淀粉会导致淀粉合成相关酶基因 AGPL4、AGPS2、GBSSI、SSI、SSIIa、BEI、BEIIb、ISA1、ISA2 和PUL的表达下降、发育胚乳总蛋白中的ISA1丰度降低。因此,PTST2基因参与调控水稻花粉和胚乳淀粉的合成与积累。突变后胚乳中出现异型淀粉粒,支链淀粉长分支侧链含量降低,花粉中淀粉颗粒积累异常导致小穗育性降低。研究结果将拓展我们对淀粉合成及其调控机制的认知,为稻米的品质培育提供遗传材料。