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Harpin蛋白是由hrp基因编码的抗病激活蛋白,也是一种耐热蛋白,通过革兰氏阴性植物病原细菌Ⅲ型泌出系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)分泌,既能诱导非寄主植物产生过敏性坏死反应(Hypersensitive response,HR),同时其本身又是病原菌的一种致病因子。目前国内外对Harpin蛋白的作用机制已有深入研究,但对于它的耐热机制尚未见专门的研究报道。为了研究HarpinX的耐热机制,本研究以来自黄单胞菌的HpaXm、Hpa1Xoo、HpaXam和HpaXcm为材料,利用生物信息学技术深入分析了蛋白结构特征;通过烟草叶片表型试验和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,从表观和微观两方面探索了高温对蛋白功能的影响;通过检测蛋白吸光度和圆二色(Circular dichroism,CD)光谱,探究了高温对蛋白结构的影响:利用定点突变技术对蛋白coiled-coil(CC)结构进行改造,验证了 CC结构与蛋白热稳定性的关系。主要研究结果如下:1.通过烟草叶片HR表型试验分析比较4种HarpinX蛋白的热稳定性,发现高温对Hpa1Xoo和HpaXcm的HR活性影响不明显,说明热稳定性较好;高温使得HpaXm和HpaXam的HR活性明显下降,说明热稳定性较差。2.通过检测蛋白吸光度,发现HarpinX吸光度随处理温度的增加而上升,推测高温使包埋在结构内部的苯丙氨酸逐渐暴露,蛋白结构逐渐展开。通过CD光谱检测二级结构含量,发现高温处理后HarpinX的α-螺旋含量增加至接近100%。进一步证实高温使HarpinX的蛋白结构发生变化,促进其他二级结构向α-螺旋转化。3.通过表型试验发现,HarpinX的HR活性随高温变化不明显。利用qRT-PCR对NtEXP6、Hin1、HSR203J、NPR1、PR-1a表达情况进行检测,发现高温使各基因表达量发生了不同程度的变化。推测HarpinX的耐热性与蛋白空间结构关系微弱,但蛋白诱导基因表达的能力与蛋白空间结构关系密切。4.利用生物信息学对蛋白进行分析,发现在HarpinX蛋白N末端的α-螺旋区域都能够形成CC结构,但形成的可能性各有不同。利用定点突变技术改造CC结构,成功获得突变体 HpaXmAL39A、HpaXmAD40A、Hpa1XooAL40A、Hpa1Xoo△D41A、HpaXam△L44A、HpaXamAM54L、HpaXcmAL40A 和 HpaXcmAD41A。通过 Western blot发现,HpaXam的Leu44对蛋白可溶性表达至关重要。结合CC结构预测结果发现,若破坏CC的形成,相应突变体的热稳定性随之变弱;反之,若加强CC的形成,相应突变体的热稳定性随之增强。5.综合以上结果推测,高温使HarpinX的空间结构逐渐展开,但蛋白的HR活性具有耐热性,可能是由于高温无法破坏蛋白的氨基酸序列,所以序列中heptad的关键氨基酸仍能够通过疏水作用力形成CC结构,因此高温处理后的HarpinX蛋白仍然能与烟草叶片中的互作蛋白进行互作,从而产生HR坏死斑。对HarpinX蛋白的耐热机制进行初探,不仅为深入研究Harpin蛋白的作用机理奠定基础,也为改造工业上非耐热蛋白提供理论依据。