针刺治疗疼痛类疾病的疗效已在国内外临床实践中获得了认可,其作用机制也一直是针灸学术研究的热点。针刺镇痛的现代基础研究较多聚焦于神经系统:针刺所产生的伤害性刺激信息通过感觉神经的传入,在中枢神经系统中通过神经系统及神经内分泌途径来实现对疼痛调控。有研究观察到与疼痛部位相同脊髓节段的低强度电针可通过脊髓闸门机制减少疼痛信息的引入,显著减轻肌肉炎性痛模型大鼠的疼痛并抑制异常肌电的放电频率。还有研究证实与疼痛部位不同脊髓节段的高强度电针刺激可触发弥漫性伤害抑制性控制（Diffuse noxious inhibitory controls,DNIC）效应,抑制大鼠单侧坐骨神经炎诱发的C纤维反射。此外,韩济生等通过实验明确了不同频率的电针刺激可以促进中枢神经系统中不同种类内源性阿片肽的释放,并激活中枢相应的阿片受体以提高大鼠足底热痛阈,发挥镇痛效应。说明中枢神经系统是电针发挥镇痛效应的重要因素。自1977年Besedovsky提出神经-内分泌-免疫网络的概念以来,该理论在针灸疗法防病治病的机制解释中发挥了积极作用。其中神经系统起主导作用,内分泌和免疫系统也发挥着不可忽视的调节作用。但对于针灸刺激是否可以通过神经-免疫途径发挥对痛觉的调节作用,相关的研究不多。在炎症过程中,病原体入侵造成的组织损伤导致局部组织中驻留白细胞释放血管活性物质和趋化因子,从而将免疫细胞从血管募集到炎症部位。组织驻留和募集的免疫细胞分泌炎症介质,包括细胞因子、脂质介质和生长因子,并激活伤害感受器感觉神经元产生疼痛。同时在炎症局部,有研究观察到白细胞迁移到炎症部位,释放β-内啡肽（β-Endorphin,β-EP）,激活外周阿片受体以抑制炎症导致疼痛的现象;作用于特异性阿片受体的β-EP可使疼痛局部神经末梢超极化,抑制初级传入神经伤害性信息向脊髓背角的传递。发表在柳叶刀杂志的一篇综述中,特别提到,这种由免疫系统介导的外周镇痛效应,有可能也是针灸发挥镇痛效应的途径之一。但由于聚焦于免疫系统的针刺镇痛效应研究数量较少,这些含β-EP的免疫细胞如何通过针灸干预,在神经系统的调控下而发挥镇痛效应的机制尚不清晰。因此本研究以肌肉炎性痛模型大鼠为研究对象,系统地探讨在电针干预对肌肉炎性痛模型大鼠的神经免疫镇痛机制。阐明炎症局部电针干预激活交感神经,从而募集含β-EP的免疫细胞迁移到炎症部位,发挥镇痛作用的机制,为“以痛为输”原则下针刺治疗疼痛提供全面、有力的证据。1研究目的因此本研究以肌肉炎性痛模型大鼠为研究对象,通过观察局部电针干预对大鼠自发痛行为、炎性肌肉组织中β-EP表达的影响,并采用流式细胞技术比较正常组、模型组和电针组炎症部位和局部引流淋巴结中表达β-EP的免疫细胞种类和数量的差异,明确局部电针的镇痛效应与表达β-EP的免疫细胞之间的关系。此外,我们继续探讨了交感神经对电针镇痛效应的影响,检测了正常组、模型组和电针干预组炎症部位交感神经递质—去甲肾上腺素含量,并分析了去甲肾上腺素含量与趋化因子基因表达之间的相关性。通过以上研究,阐明炎症局部电针干预激活交感神经,从而募集含β-EP的免疫细胞迁移到炎症部位所发挥神经免疫学镇痛机制,为“以痛为输”针刺治疗疼痛提供全面、有力的证据。2研究方法2.1实验动物的分组2.1.1将72只Wistar大鼠随机分为正常组（8只）和模型组（64只）。将200μl完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）注射入模型组大鼠股二头肌后侧,然后将模型组随机分为造模后第1、3、5、7、9、11、13和15天组,每组8只大鼠。使用双足平衡仪观察并评估各组大鼠自发痛行为,并通过对外周血和炎症组织中炎性因子的定量分析,对模型大鼠进行15天的病理生理进程观察,以确定电针干预时间。2.1.2将48只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、电针组和抗β-EP抗体注射+电针组,每组各12只。造模后第4天,在异氟烷麻醉状态下,给予电针组和Anti-β-EP+电针组大鼠疼痛局部电针干预。正常组和模型组大鼠不进行电针干预,其余实验条件与电针组、Anti-β-EP+电针组大鼠相同。2.1.3将48只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、电针组和6-OHDA注射+电针组,每组各12只。造模后第4天,在异氟烷麻醉状态下,给予电针组和6-OHDA注射+电针组大鼠疼痛局部电针干预。正常组和模型组大鼠不进行电针干预,其余实验条件与电针组、6-OHDA注射+电针组大鼠相同。2.2动物模型的制备选用清洁级健康雄性Wistar大鼠,体重范围200-220 g之间。在异氟烷吸入麻醉条件下,将大鼠固定于俯卧位,对左侧后肢进行备皮。在左侧股二头肌后侧注入200 μl的完全弗氏佐剂（Complete Freund’s Adjuvant,CFA）,注射深度约0.5 cm,注射时间大于30 s,缓慢出针防止药液渗漏。2.3电针干预使用痛觉测痛仪确定大鼠左后肢注射CFA部位中机械痛阈值最低的区域,并在此区域进行电针干预。造模后第4天,电针组、抗β-EP抗体注射+电针组、6-羟基多巴胺氢溴酸盐（6-Hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA）+电针组大鼠均在异氟烷的麻醉状态下（浓度1.5%,流量0.8～1 L/min）,进行电针干预,电针参数为:2/100 Hz,1 mA,30 min/次,每天1次,连续3天给予干预。正常组和模型组大鼠除不进行电针干预外,其余实验条件均相同。2.4抗β-EP抗体和交感神经阻滞剂6-OHDA的预处理使用大鼠β-EP作为抗原物质,制备兔抗β-EP抗体。从兔抗血清中纯化出Anti-β-EP多克隆抗体,最终浓度为8 mg/ml。每次电针干预30 min前,在Anti-β-EP+电针组大鼠电针干预的部位注射Anti-β-EP抗体（100μl/只）。将6-OHDA溶解在含有0.2%（w/v）抗坏血酸（溶剂）的生理盐水中,浓度为100 mg/ml。在第一次电针干预前的30 h和每次电针干预前6 h,向6-OHDA+电针组大鼠电针干预的部位注射6-OHDA（100μl/只）阻滞局部交感神经活动。2.5疼痛行为学测试本研究以大鼠双足承重差值作为自发痛的检测指标。采用双足平衡仪检测大鼠站立时双后肢站立时压力传感器的受力情况。双足承重差值=健侧后肢的受力值（右侧）-患侧后肢的受力值（左侧）,作为自发痛行为的指标。2.6 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）大鼠在异氟烷深度麻醉下经心脏采血,使用含抗EDTA的采血管收集血液,然后将大鼠放入二氧化碳箱内处死。使用12 mm皮肤提取器取出炎症区域的肌肉组织并放入液氮中,低温研磨并称量后置于-80℃冰箱保存。根据制造商的说明使用不同的ELISA试剂盒对提取的蛋白进行以下指标检测:β-EP、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）。2.7免疫组织化学/免疫荧光染色于实验第6天,随机选取模型组（3只）、电针组（3只）大鼠用1%戊巴比妥钠溶液（10 ml/kg）深度麻醉,然后经心灌注固定后,取左股骨头至踝关节的肌肉组织。切片在含有3%正常驴血清和0.5%Triton X-100的10%BSA溶液中室温条件下封闭30 min,然后在4℃条件下在含有β-EP、ICAM-1或CD11b抗体（浓度均为1:500）的溶液中孵育过夜。经1×磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Solution,PBS）中清洗3次后,室温条件下在含有二抗的溶液中孵育30 min。经1×PBS清洗3次后,用封片剂进行封片,并在激光共聚焦显微镜下进行观察。2.8流式细胞分析在深度麻醉后将大鼠放入二氧化碳箱处死,取等量炎性肌肉组织和局部引流淋巴结放入含细胞解离液的离心管中。消化组织后获得细胞悬液,随后将收集到的细胞,加入固定试剂在室温条件下孵育15 min进行固定。将偶联了不同荧光标签的β-EP、ICAM-1或CD11b抗体加入破膜试剂中在室温条件下孵育15 min后,上机检测。2.9蛋白免疫印迹（Western blot）实验使用BCA蛋白定量法测得各组样本的蛋白浓度,并以RIPA调整样品蛋白浓度为4mg/ml。10×SDS-PAGE电泳将提取的蛋白质,作为内部参照物处理90 min。然后将蛋白转移到聚二氟乙烯膜（PVDF）上,用5%脱脂奶粉封闭2 h。将兔来源的ADR-β2单克隆抗体用5%脱脂牛奶-TBST稀释（稀释度1:5000）并添加到膜上,室温孵育10 min,在4℃条件下反应过夜。用5%脱脂牛奶-TBST稀释山羊抗兔IgG抗体（稀释度1:2000）并添加到膜上,室温轻摇孵育40 min。将膜浸入增强化学发光检测试剂（ECL）中反应3-5 min,胶片曝光显影后,对胶片放射自显影图进行分析并定量。2.10转录组测序分析采用Trizol法提取各组样本总RNA,并在北京奥维森基因科技有限公司完成RNA测序分析。用Nanodrop和Agilent 2100分别检测RNA纯度和完整性。样品检测合格后,使用带有Oligo（dT）的磁珠富集得到mRNA,再加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段。随后,用六碱基随机引物以mRNA为模板进行反转录合成cDNA,并进行末端修复、加A、加接头。通过AMPure XP beads对双链cDNA进行片段大小选择,最后进行PCR扩增以构建cDNA文库。建好的文库先进行文库质检,质检合格的文库使用Illumina高通量测序平台,采用PE150测序策略。对下机的原始数据Raw reads质控后,获得Clean reads。分别利用star和Cufflinks软件完成比对和转录本拼接分析,然后对所有基因进行定量分析。2.11实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time PCR）为了验证从转录组测序获得的结果,我们使用实时PCR以确定免疫细胞趋化过程相关的Ccl5、Cxcl1和Cxcl6基因mRNA的表达水平。采用TRNzol法进行样本RNA提取,并将各样本2μg的总RNA反转录合成cDNA。定量实时P CR扩增在Real-time PCR反应系统上进行。扩增程序为95℃,30 s;40个PCR循环（95℃,5 s;60℃,40 s（收集荧光））。为了建立PCR产物的熔解曲线,扩增反应结束后,按（95℃,10 s;60℃,60 s;95℃,15 s）;并从60℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/s）。使用的引物如下:Cc15:上游 5’-CCTCACCGTCATCCTCGTT-3’和下游 5’-GACTGCAAGGTTGGAGCAC T-3’;Cxcl1:上游 5’-GCACCCAAACCGAAGTCAT-3’和下游 5’-GGGGACACC CTTTAGCATCT-3’;Cxc16:上游 5’-CCCCAAGGTGGAAGTCATAG-3’和下游 5’-GTGCATTCCGCTTTGTTTTC-3’。根据扩增曲线获得目标基因和参考基因的C t值。对每个样本进行三次重复,并使用2-ΔΔct相对定量计算公式,计算出各样品的目的基因相对定量结果。2.12统计学处理采用SPSS26.0统计分析软件对实验数据进行处理,计量资料以平均数±标准误（x±se）表示。先进行正态分布及方差齐性检验,符合正态分布且方差齐者,采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Tukey HSD检验;不满足方差齐性或正态分布则采用Dunnett’s T3检验,以P＜0.05作为差异有统计学意义的标准。采用Person相关分析法分析炎症组织中NE含量与Cxcl1 mRNA表达水平之间的相关性,以P＜0.05作为差异有统计学意义。3研究结果3.1 CFA肌肉注射造成肌肉炎性反应的病理生理变化的观察CFA肌肉注射可诱导肌肉炎性反应的发生,具体表现为:股二头肌后侧注射CFA后第4天,可观察到注射部位肌肉组织中出现大量炎性滤泡。通过双足平衡仪对大鼠自发痛行为进行观察:造模前,正常组与模型组大鼠双足承重差值之间无明显差异;与正常组（0.37±5.80 g）相比,造模后第1天模型大鼠双足承重差值（17.87±5.28 g）明显升高（P＜0.05）,该差异可持续到造模后第9天;造模后第10天,正常组与模型组双足差值无显著差异（P＞0.05）。造模后第1天,模型大鼠炎症组织中IL-1β的含量为9615.42±3716.51 pg/mg,与正常组（269.81±89.86 pg/mg）相比,极显著升高（P＜0.01）。造模后第1天,模型大鼠外周血中IL-1β的含量为14.30±3.20 pg/ml,与正常组（7.96±4.67 pg/ml）相比,显著升高（P＜0.05）。造模后第3天,模型大鼠炎症组织IL-1β的含量为4313.16±2736.49 pg/mg,与正常组相比,显著升高（P＜0.05）,该差异可持续到造模后第15天。造模后第3天,模型大鼠外周血中IL-1β的含量为7.72±2.23 pg/ml,与正常组相比,无统计学差异（P＞0.05）。因此我们选择在造模后第四天进行电针干预。3.2局部干预电针可通过增加炎症组织中β-EP的含量来发挥镇痛作用造模后第6天,电针组大鼠的双足承重差值为18.28±6.25g,与模型组（26.67±5.68 g）相比明显降低（P＜0.05）。Anti-β-EP+电针组大鼠的双足承重差值为29.98±9.32 g,与电针组相比显著升高（P＜0.05）。与正常组（3500.02±984.68 pg/mg）相比,模型组大鼠炎症组织中的β-EP含量（5153.60±1599.23 pg/mg）显著增加（P＜0.05）。电针组大鼠炎症组织中的β-EP含量为6899.96±1809.47 pg/mg,与模型组相比明显增加（P＜0.05）。与正常组（536.03±114.69 pg/ml）和电针组（524.43±130.60 pg/ml）相比,模型组外周血中 β-EP 含量（475.46±120.07pg/ml）无显著差异（P＞0.05）。3.3电针促使含β-EP的免疫细胞向炎症部位募集并释放镇痛物质从而缓解炎性痛通过形态学的研究方法,采用免疫荧光染色技术在模型组大鼠炎症组织和引流淋巴结中观察到β-EP阳性的免疫细胞。造模后第6天,与模型组相比,电针组大鼠炎症组织中含β-EP的ICAM-1+/CD11b+细胞数量增加。造模后第6天,电针组引流淋巴结和炎症组织中粒细胞和单核细胞所占比例为12.04±2.23%,与正常组（7.73±1.74%）和模型组（10.08±2.08%）相比明显升高（P＜0.05）。正常组和模型组中β-EP+细胞所占粒细胞和单核细胞比例分别为71.61±19.86%、43.18±20.15%,与电针组（24.44±12.57%）相比明显升高（P＜0.05）。正常组和模型组中β-EP与CD11b共表达的细胞占粒细胞和单核细胞比例分别为73.89±14.40%、57.36±14.95%,与电针组（39.99±11.51%）相比明显升高（P＜0.05）。模型组和电针组中β-EP和ICAM-1共表达的细胞占粒细胞和单核细胞比例分别为 54.92±12.78%、40.29±12.55%,与正常组（75.89±14.98%）相比明显降低（P＜0.05）。3.4交感神经的激活参与电针的局部镇痛效应使用分子生物学技术,观察了各组大鼠炎症组织中去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）的含量,与肾上腺素β2受体的表达。与正常组（61.08±6.89 pg/mg）相比,模型组大鼠炎症组织中去NE的含量（38.74±6.03 pg/mg）显著降低（P＜0.05）。电针组大鼠炎症组织中NE的含量为46.57±7.09 pg/mg,与模型组相比显著升高（P＜0.05）。6-OHDA+电针组大鼠炎症组织中NE的含量（7.35±1.80 pg/mg）与其余三组相比,显著降低（P＜0.05）。电针组大鼠局部组织中的肾上腺素β2受体（Adrenergic Receptors-β2,ADR-β2）蛋白相对灰度值为1.11±0.11,与模型组（0.79±0.10）相比显著上调（P＜0.05）。造模后第6天,6-OHDA+电针组大鼠的双足承重差值为23.16±5.87 g,与电针组（11.12±4.46 g）相比显著升高（P＜0.05）,6-OHDA预处理可消除电针干预所产生的镇痛效应。本研究采用转录组测序分析来评估电针对大鼠炎症组织中趋化因子及黏附因子基因表达的影响。与模型组相比,电针组大鼠炎症组织中Cxcl1和Cxcl6的基因表达水平显著上调（P＜0.05）,而Ccl5的基因表达水平显著下调（P＜0.05）。电针组大鼠炎症组织中其余基因的表达与模型组相比无显著差异（P＞0.05）。本研究通过定量实时的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）验证了这一结果。Person相关分析结果显示炎症组织中NE含量与Cxcl1 mRNA表达水平之间存在相关性,Person相关系数有统计学意义（r=0.5404,P=0.0307）。4结论1.在炎症部位,针刺通过增加局部组织中内源性β-EP的含量来发挥外周镇痛效应。2.电针干预通过募集含β-EP的ICAM-1+/CD11b+免疫细胞提高炎症局部β-EP的含量。3.局部交感神经纤维的激活参与电针诱导的外周内源性阿片镇痛效应。