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背景:冠心病全球发病率呈上升态势,是当今世界上主要的致死因素,每年大约有740万人死于冠心病。美国目前约有1000万人患有心绞痛,每年确诊患者达50万例。2020年《中国心血管健康与疾病报告》显示我国约有3.3亿心血管病患者,冠心病约有1139万人次。心血管疾病严重威胁国民健康,给国家和社会带来严重的经济负担。血脂异常是心血管疾病的重要危险因素,而我国血脂异常知晓率、治疗率和控制率均处于较低水平。中医学认为血脂异常多与嗜食肥甘厚味、生冷烟酒,脾胃运化失常,痰浊内生有关。痰浊证是冠心病的重要证型。外泌体携带有大量的生物信息,参与细胞间物质、信息传递,能够直接作用于靶器官和组织,参与机体免疫、炎症反应等生物过程,而蛋白质是生物功能的直接表现者,因此深入研究冠心病痰浊证患者血浆外泌体蛋白质表达水平具有重要意义。目的:本研究旨在探索冠心病与健康人、冠心痰浊证与冠心病非痰浊证血浆外泌体蛋白表达情况,并采用靶向蛋白标记技术对差异蛋白进行验证,以期为冠心病痰浊证患者的临床诊治提供更多的生物学证据。方法:实验一:收集2021年7月至2021年11月就诊于心血管科及综合科病房的冠心病患者120例,匹配同时期同年龄段就诊于预防保健科健康体检者30例。采集临床基本资料后,抽取所有受试者空腹静脉血,运用化学分析法测定血清中总胆固醇（Cholesterol,CHO）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、极低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein,VLDL）、载脂蛋白 A1（Apolipoprotein A1,Apo A1）、载脂蛋白B（Apolipoprotein B,Apo B）等生化指标。随机选择冠心病患者20例和健康对照组受试者10例,运用qEV尺寸排阻法提取空腹血浆中的外泌体,利用透射电镜、纳米微粒追踪检测（Nanoparticletrackinganalysis,NTA）和蛋白印迹（Western Blot,WB）对外泌体进行鉴定,采用label free非标记蛋白质谱技术检测两组外泌体蛋白质表达水平,利用生物信息学技术分析组间差异表达蛋白。再次随机选择冠心病患者20例和健康对照组受试者10例,通过MRM靶向蛋白标记技术对部分差异蛋白进行验证。实验二:收集2021年7月至2021年11月就诊于心血管科及综合科病房的冠心病痰浊证患者80例和冠心病非痰浊证患者40例。采集临床基本资料后,抽取所有受试者空腹静脉血,运用化学分析法测定血清中CHO、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL、Apo A1、Apo B等生化指标。随机抽取冠心病痰浊证和冠心病非痰浊证患者各10例,运用qEV尺寸排阻法提取空腹血浆中的外泌体,利用透射电镜、NTA、WB对外泌体进行鉴定,采用label free非标记蛋白质谱技术检测两组外泌体蛋白质表达水平,利用生物信息学技术分析组间差异表达蛋白。再次随机选择冠心病痰浊证和冠心病非痰浊证患者各10例,通过MRM靶向蛋白标记技术对部分差异蛋白进行验证。统计方法:使用SPSS25.0统计软件分析数据,P＜0.05作为统计学差异的判断依据。符合正态分布或近似正态分布的计量资料以X±S表示,组间比较采用t检验,不符合正态分布的计量资料以四分位数表示,组间比较采用秩和检验;计数资料以频数、百分比表示,组间比较采用卡方检验和费舍尔精确检验。结果:实验一:1.基线结果:冠心病组和健康对照组在性别、年龄、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、肌酐（Creatinine,Cr）方面无统计学差异（P＞0.05）。2.体重指数（Body mass index,BMI）、糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin,HbA1c）、血脂结果:和健康对照组相比,冠心病患者BMI、HbA1c、TG、VLDL水平明显升高（BMI:25.69±3.65 kg/m2 VS 20.98±2.10 kg/m2;HbA1c:6.71±1.35%VS 4.73±0.37%;TG:1.73±0.96 mmol/L VS 0.88±0.30 mmol/L;VLDL:0.78±0.44 mmol/L VS 0.43±0.16mmol/L;P＜0.001）;HDL-C 明显降低（1.06±0.24mmol/LVS 1.32±0.30mmol/L,P＜0.001）;CHO、LDL-C、Apo A1、Apo B 水平未见统计学差异（P＞0.05）。3.冠心病患者血浆外泌体蛋白质谱研究结果3.1冠心病患者外泌体鉴定结果:①电镜视野下可见清晰圆形或类圆形的囊泡结构,类似“杯口茶托”,大小约在100nm左右;②NTA检测粒径大小为125.2nm;③使用WB检测所提取外泌体表面标志性蛋白,3个阳性蛋白:CD9、CD81、HSP70;1个阴性蛋白:Calnexin;以上结果均符合外泌体的检测标准,说明外泌体样本合格。3.2冠心病患者非标记定量蛋白组学结果:与健康对照组相比,冠心病组共检测到ANXA6等92个蛋白表达上调（P＜0.05）;GSTM5等101个蛋白表达下调（P＜0.05）。3.3冠心病患者差异表达蛋白功能分析结果:与健康对照组相比,GO富集分析发现冠心病组差异表达蛋白主要参与了“immune effector process（免疫效应）”、“complement activation（补体激活）”、“vesicle-mediated transport（囊泡介导的运输）”等生物过程;发挥“antigen binding（抗原结合）”、“lipoprotein particle receptor binding（脂蛋白颗粒受体结合）”、“lipid binding（脂质结合）”等分子功能;影响“extracellular space（细胞外区域）”、“extracellular exosome（细胞外外泌体）”、“extracellularvesicle（细胞外囊泡）”等细胞组分。与健康对照组相比,KEGG富集分析显示冠心病组差异表达蛋白主要参与“Complement and coagulation cascades（补体和凝血级联）”、“Cholesterolmetabolism（胆固醇代谢）”、“Focaladhesion（黏着斑）”等信号通路。3.4冠心病患者部分差异表达蛋白验证结果:选定29个差异表达蛋白进行MRM靶向蛋白验证,最终发现 ANXA6、C4BPB、PRG4、F8、CFB、载脂蛋白E（Apolipoprotein E,Apo E）、C9、CLU与非标记定量蛋白组学结果表达趋势一致,且具有统计学意义（P＜0.05）。3.5冠心病患者差异表达蛋白ROC曲线结果:冠心病组与健康对照组差异表达蛋白 ANXA6、C4BPB、PRG4、F8、CFB、Apo E、C9 的 ROC 曲线下面积均在 0.79 以上（ANXA6:0.82;C4BPB:0.90;PRG4:0.83;F8:0.81;CFB:0.80;Apo E:0.85;C9:0.86;P＜0.01）,CLU蛋白的ROC曲线下面积高达0.93（P＜0.001）。实验二:1.基线结果:冠心病痰浊证组和冠心病非痰浊证组在性别、年龄、ALT、AST、Cr等方面无统计学差异（P＞0.05）。2.BMI、HbAlc、血脂及降脂药使用情况:和冠心病非痰浊证相比,冠心病痰浊证患者BMI、高脂血症患病率、TG水平、VLDL水平升高（P＜0.05）;HbA1c、糖尿病患病率、CHO、HDL-C、LDL-C、Apo A1、ApoB及两组降脂药物使用情况未见统计学差异（P＞0.05）。3.冠心病痰浊证患者血浆外泌体蛋白质谱研究结果3.1冠心病痰浊证患者外泌体鉴定结果:①电镜视野下均可见清晰圆形或类圆形的囊泡结构,类似“杯口茶托”,大小约在100nm左右;②NTA检测到样本粒径大小为116.0nm;③使用WB检测所提取外泌体表面标志性蛋白,3个阳性蛋白:CD9、CD81、HSP70;1个阴性蛋白:Calnexin;以上结果均符合外泌体的检测标准,说明外泌体样本提取合格。3.2冠心病痰浊证患者非标记定量蛋白组学结果:与冠心病非痰浊证相比,冠心病痰浊证组共检测到ANXA6等28个蛋白表达上调（P＜0.05）;C4BPB等14个蛋白表达下调（P＜0.05）。3.3冠心病痰浊证患者差异表达蛋白生信分析结果:与冠心病非痰浊证组相比,GO富集分析发现冠心病痰浊证组差异表达蛋白主要参与了“leukocyte mediated immunity（白细胞介导的免疫）”、“neutrophil degranulation（中性粒细胞脱粒）”等生物过程;发挥“phospholipid binding（磷脂绑定）”、“lipase inhibitoractivity（脂肪酶抑制剂的活性）”、“lipoproteinparticlereceptorbinding（脂蛋白颗粒受体结合）”、“cholesterol binding（胆固醇绑定）”、“lipid binding（脂质结合）”等分子功能;改变“extracellular exosome（细胞外外泌体）”、“extracellularvesicle（细胞外囊泡）”等细胞组分。与冠心病非痰浊证相比,KEGG富集分析显示冠心病痰浊证组差异表达蛋白主要参与“Endocytosis（内吞作用）”、“Complement and coagulation cascades（补体和凝血级联）”、“Cholesterol metabolism（胆固醇代谢）”等信号通路。3.4冠心病痰浊证患者部分差异表达蛋白验证结果:选定8个差异表达蛋白进行MRM靶向蛋白验证,最终发现ANXA6、C4BPB、PLEK与非标记定量蛋白组学结果表达趋势一致,且具有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.和健康对照组相比,冠心病患者血浆外泌体共有ANXA6等92个蛋白表达水平上调,共有GSTM5等101个蛋白表达水平下调,两组间差异表达蛋白主要与免疫效应、胆固醇代谢、补体和凝血级联等有关。2.和冠心病非痰浊证相比,冠心病痰浊证患者血浆外泌体共有ANXA6等28个蛋白表达上调,共有C4BPB等14个蛋白表达下调,两组间差异表达蛋白主要与脂质结合、补体和凝血级联、胆固醇代谢有关。