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背景口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其预后常为不良。据报道,每年约新确诊37万例口腔癌患者,约占全世界报告的所有恶性肿瘤新增患者数量的2%,其中舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)占50%以上。目前针对舌部恶性肿瘤,传统的治疗方法为手术切除、放疗、化疗及联合治疗。由于舌解剖位置的特殊性,针对TSCC的根治性手术日后常影响患者的外观及进食,极大损害了肿瘤患者的生存质量和社会心理健康。虽然最近的研究表明口腔鳞癌患者的5年生存率从1986年的55%提高到近年来的60%,但其存活率的提高程度却远远低于其他类型的癌症。目前研究认为TSCC的发生大多数与吸烟、过度饮酒和咀嚼槟榔等生活方式中的风险习惯有关,也有科学家提出是原癌基因和抗癌基因的遗传改变积累导致了TSCC的出现,而TSCC的进展是一个涉及多步骤的复杂生物学过程,癌细胞转移的启动常与EMT过程的异常激活高度相关,这使癌细胞能够从原发肿瘤向周围及远处组织转移扩散。但目前TSCC的潜在发病机制,以及进展机制,尚不完全清楚。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMP)属于TGF-β家族,在胚胎早期的发育和稳态中发挥包括骨形成、再生等重要作用。近年来,多项研究表明BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7等BMPs也参与肿瘤的发生与发展。与BMP家族在肿瘤中作用的较为充分研究相比,其拮抗剂在肿瘤中的研究相对有限。作为BMP家族的拮抗剂,腱蛋白样蛋白1(Chordin like-1,CHRDL1)最初因在发育中的视网膜中表达而被发现。CHRDL1突变常与X染色体-连锁的巨型角膜有关,最近的研究发现CHRDL1与多种癌症相关,然而现有的关于CHRDL1与肿瘤相关性的研究大多仅停留在生物信息学分析水平,但CHRDL1是否在癌症中具有因果作用尚不明晰。此外,未见其在TSCC中的作用和调控机制的相关报道。CHRDL1在TSCC中的确切功能和分子机制尚不清楚。目的本实验旨在研究CHRDL1在TSCC临床组织及细胞系中的表达,探究其在TSCC发生发展中的潜在分子机制。材料与方法1.在收集到的TSCC临床组织样本及癌旁对照组样本中,使用RT-qPCR的方法分析CHRDL1在二者间基因水平上的表达,使用免疫组织化学染色的方法分析CHRDL1在二者间蛋白水平上的表达与分布;2.在正常组细胞系(HOK)和TSCC细胞系(CAL 27)中,通过RT-qPCR的方法,从基因水平比较两组细胞内CHRDL1的表达;3.通过慢病毒介导构建稳定过表达/敲低CHRDL1的TSCC细胞系模型并使用RT-qPCR和Western Blot的方法进行转染效率的验证;采用划痕实验、transwell实验、细胞黏附实验、Ed U细胞增殖实验、CCK8实验和克隆形成实验,评价稳定过表达/敲低CHRDL1对TSCC细胞系迁移、侵袭、黏附和增殖等恶性生物学行为的影响;4.体外通过尾静脉注射稳定过表达/敲低CHRDL1的CAL 27细胞构建裸鼠肺转移模型,评价稳定过表达/敲低CHRDL1对TSCC细胞在裸鼠体内向肺部的转移和定植能力的影响;5.使用RNA测序技术对稳定过表达/敲低CHRDL1的TSCC细胞系(CAL27)进行测序,获得基因表达谱数据,对细胞系中差异表达基因进行GO功能富集和KEGG信号通路富集分析,并使用Western Blot的方法对MAPK信号通路相关蛋白进行验证。结果1.CHRDL1在TSCC患者肿瘤组织中为低表达,其表达水平低于癌旁组织;2.CHRDL1在TSCC细胞系CAL 27细胞中为低表达,其表达水平低于正常黏膜上皮角质细胞系HOK细胞;3.使用搭载过表达/敲低CHRDL1载体的慢病毒感染细胞系并进行筛选,可构建稳定过表达/敲低CHRDL1的TSCC细胞系;4.过表达CHRDL1可通过抑制TSCC细胞系的EMT,进而抑制细胞的体外迁移、侵袭和黏附能力;而敲低CHRDL1可通过促进TSCC细胞系的EMT,进而促进细胞的体外迁移、侵袭和黏附能力;5.过表达或敲低CHRDL1均对TSCC细胞系的体外增殖能力无影响;6.过表达CHRDL1可抑制TSCC细胞系在体内向肺部的转移和定植能力,而敲低CHRDL1则可增强TSCC细胞系在体内向肺部的转移和定植能力。7.在TSCC中,CHRDL1表达水平变化可引起多条细胞信号通路的改变,例如MAPK信号通路。结论1.CHRDL1在TSCC患者肿瘤组织及细胞系中为低表达;2.用搭载过表达/敲低CHRDL1载体的慢病毒成功构建过表达/敲低CHRDL1的TSCC细胞系并通过实验验证在TSCC中过表达CHRDL1可通过抑制TSCC细胞系的EMT,进而抑制TSCC细胞系的恶性生物学行为如迁移、侵袭和黏附等,体内可抑制TSCC细胞系向肺部的转移和定植能力;敲低CHRDL1会通过促进TSCC细胞系的EMT,进而促进TSCC细胞系的恶性生物学行为如迁移、侵袭和黏附等,体内可增强TSCC细胞系向肺部的转移和定植能力;3.体外过表达/敲低CHRDL1可通过调控MAPK信号通路影响TSCC细胞系的EMT过程,进而影响其迁移、侵袭和黏附等恶性生物学行为。本课题组的研究提示CHRDL1可能通过MAPK信号通路对TSCC转移起抑制作用,为TSCC的治疗提供了一个新的、潜在的治疗靶点。