溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种慢性、非特异性炎症性肠病,致病机制尚未明确;目前认为与环境、遗传基因、机体免疫等诸多因素有关。临床表现多为腹痛、腹泻、脓血便等,主要病理特征为结肠黏膜慢性炎症和溃疡性损伤。近年来,世界各地UC发病率呈上升趋势,严重影响患者正常工作与生活。目前,临床治疗多采用水杨酸类和糖皮质激素等药物治疗UC,长期使用存在严重不良反应。中药多组分、多靶点和整体治疗的特点,不良反应相对较轻。中医长于“辨证论治”,在UC的治疗和预防方面有明显优势。因此,运用中医药治疗UC受到越来越多的关注,中药有望成为开发新药的重要来源,在UC治疗方面具有广阔的前景。五味子是木兰科(Magnoliaceae)植物五味子的干燥成熟果实。具有“收敛固涩、益气生津、补肾宁心”等功效。五味子甲素(Schisandra A)是五味子中木脂素类成分之一,研究表明,其具有护肝、抗氧化、抗炎、镇静、抗肿瘤等作用,对于其影响胃肠运动功能以及治疗UC的研究目前鲜有报道。根据文献,本研究分别采用含2.5%三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic,TNBS)的50%乙醇混合溶液灌肠诱导小鼠UC模型,采用5%(W/V)葡聚糖硫酸钠(Dextra sulfate sodium,DSS)溶液(自由饮用)建立大鼠UC模型;通过观察模型动物一般临床症状及组织病理损伤情况;检测结肠组织相关炎症因子水平以及NF-κB/COX-2和IL-6/STAT3两条通路的相关蛋白与基因的变化,初步探讨五味子甲素对UC的抗炎作用及相关机制,为五味子甲素的新药研发及临床应用提供理论依据。第一章五味子甲素对小鼠及大鼠胃肠运动的影响目的:采用小鼠在体动物模型及大鼠离体肠平滑肌模型,考察五味子甲素对胃肠运动的影响。方法:1通过给予新斯的明和番泻叶水煎液制备胃肠运动异常小鼠在体模型,灌胃给药后,考察五味子甲素对模型小鼠小肠推进率、胃残留率的影响,以及对腹泻小鼠的腹泻指数,血清中胃动素(Motilin,MTL)、胃泌素(Gastrin,GAS)水平的影响。2通过向克氏液中加入不同受体激动剂与拮抗剂,以及改变离子浓度建立不同收缩状态大鼠离体肠平滑肌模型,考察五味子甲素对大鼠离体肠平滑肌收缩性的影响。结果:1五味子甲素抑制小鼠在体胃肠运动功能五味子甲素对正常小鼠、新斯的明所致胃肠功能亢进小鼠、番泻叶所致腹泻小鼠的肠推进率均有抑制作用,提高胃残留率(P<0.05);可明显降低腹泻小鼠腹泻率、腹泻指数,显著增加腹泻潜伏时间(P<0.05);降低腹泻小鼠血清中MTL和GAS。2五味子甲素抑制大鼠离体肠平滑肌收缩通过离体肠平滑肌收缩实验发现,五味子甲素对不同收缩状态离体肠平滑肌的收缩性均有抑制作用。结论:五味子甲素可明显抑制小鼠在体胃肠运动和大鼠离体肠平滑肌收缩,对大、小鼠胃肠运动均具有抑制作用。第二章五味子甲素对三硝基苯磺酸诱导UC小鼠的治疗作用及机制研究目的:利用TNBS/乙醇溶液灌肠建立UC小鼠模型,检测UC小鼠结肠组织NF-κB/COX-2通路相关蛋白和转录基因表达情况,探究五味子甲素对UC的治疗作用及相关机制。方法:1动物分组、模型制备和给药方案将昆明种小鼠随机分为6组,分别为正常对照组(Normal组)和模型对照组(Model组),五味子甲素高、中、低剂量组(TNBS+80 mg/kg组、TNBS+40 mg/kg组、TNBS+20mg/kg组),柳氮磺吡啶阳性对照组(TNBS+SASP组)。将5%的TNBS溶于无水乙醇中制成含2.5%TNBS的50%乙醇溶液,经肛门缓慢注入小鼠结肠内,24 h后重复一次,选择造模成功的小鼠在48 h后开始给予相应治疗,每组10只,灌胃给药,每日1次,连续14 d。2五味子甲素对UC小鼠临床症状及病理损伤情况的影响观察并记录小鼠的一般表现、体重,检测UC小鼠疾病活动指数(DAI)、稀便率、粪便含水率、隐血程度、结肠转运时间以及脾脏指数,HE染色评估组织病理损伤情况。3五味子甲素对UC小鼠结肠组织NF-κB/COX-2通路的影响(1)生化试剂盒检测小鼠结肠组织中MPO、SOD、TNOS活性和MDA、NO含量。(2)ELISA法检测小鼠结肠组织中IL-6、IL-10、TNF-α、NF-κB、COX-2含量。(3)免疫组化法检测小鼠结肠组织中NF-κB、COX-2蛋白表达情况。(4)Western blot法检测小鼠结肠组织中NF-κB、COX-2蛋白表达情况。(5)RT-PCR法检测小鼠结肠组织中NF-κB、COX-2 m RNA表达情况。结果:1五味子甲素减轻UC小鼠临床症状结果显示,Normal组小鼠精神状态良好,造模后各组小鼠表现与UC临床症状相似。给予五味子甲素和SASP治疗14 d后,TNBS+80 mg/kg组、TNBS+40 mg/kg组与TNBS+SASP组小鼠体重增加,排便次数、稀便率、粪便含水率、结肠转运时间、隐血程度和DAI评分均得到明显改善(P<0.05);TNBS+80 mg/kg组与TNBS+SASP组小鼠结肠未见明显缩短,脾脏指数与Normal组比较无显著性差异。HE染色结果显示,TNBS+80 mg/kg组与TNBS+SASP组小鼠结肠组织病理损伤评分明显低于Model组(P<0.05)。2五味子甲素抑制相关炎性因子的表达实验结果显示,与Model组比较,TNBS+80 mg/kg组与TNBS+SASP组小鼠结肠组织中MPO活性明显降低(P<0.05),SOD活性升高,MDA含量降低(P<0.05),结肠组织中NO含量和TNOS活性显著降低(P<0.05)。TNBS+80 mg/kg组与TNBS+SASP组小鼠结肠组织炎性因子IL-6、NF-κB、COX-2、TNF-α含量显著减少(P<0.05),抗炎因子IL-10含量显著增加(P<0.05)。说明五味子甲素可以调节相关炎性因子水平。3五味子甲素抑制结肠组织COX-2、NF-κB m RNA的表达RT-PCR结果显示,与Model组比较,TNBS+80 mg/kg组和TNBS+SASP组结肠组织中COX-2、NF-κB m RNA的表达量显著降低(P<0.05)。4五味子甲素抑制结肠组织中COX-2、NF-κB蛋白的表达免疫组织化学和Western blot法检测结果显示,与Model组比较,TNBS+80 mg/kg结肠组织中COX-2、NF-κB蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论:五味子甲素能够明显改善TNBS/乙醇溶液诱导UC小鼠的临床症状,调节相关炎性因子表达,达到抗炎作用。作用机制可能是通过抑制NF-κB/COX-2通路相关基因转录及蛋白的表达而实现的。第三章五味子甲素对葡聚糖硫酸钠诱导UC大鼠的治疗作用及机制研究目的:通过5%(W/V)葡聚糖硫酸钠(自由饮用)诱导UC大鼠模型,考察五味子甲素对IL-6/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响,探究五味子甲素对UC大鼠的治疗作用及相关机制。方法:1动物分组、模型制备和给药方案SD大鼠随机分为6组,为正常对照组(Normal组)和模型对照组(Model组),五味子甲素高、中、低剂量组(DSS+60 mg/kg组、DSS+30 mg/kg组、DSS+15 mg/kg组),柳氮磺吡啶阳性对照组(DSS+SASP组)。通过连续自由饮用5%DSS(W/V)10 d,建立UC大鼠模型,每组8只,灌胃给予相应药物,每天1次,连续14 d。2五味子甲素对UC大鼠临床症状及病理损伤情况的影响观察并记录大鼠一般表现、体重、DAI、结肠转运时间、粪便含水率、脏器指数、结肠大体损伤情况,评估大鼠临床症状的表现。HE染色评估病理组织形态学变化。3五味子甲素对UC大鼠结肠组织IL-6/STAT3通路的影响(1)生化法检测大鼠结肠组织和血清中MPO活性;(2)ELISA方法检测大鼠结肠组织IL-6、IL-13含量;(3)免疫组化法检测大鼠结肠组织IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达的情况;(4)RT-PCR法检测大鼠结肠组织中IL-6、STAT3 m RNA表达情况。结果:1五味子甲素缓解UC大鼠临床症状造模期间,Normal组大鼠状态良好,其余各组在饮用5%DSS溶液4 d后,部分大鼠出现稀便,体重开始减少,DAI评分增加;给药14 d后,与Model组比较,DSS+60 mg/kg组和DSS+SASP组UC大鼠体重明显增加,DAI评分明显降低(P<0.05)。除DSS+15mg/kg组外,各给药组大鼠结肠转运时间延长(P<0.05),粪便含水率明显降低(P<0.05);DSS+60 mg/kg组和DSS+SASP组大鼠胸腺指数、脾脏指数均趋向正常组水平,肉眼观察可知结肠组织损伤评分降低(P<0.05)。HE染色可见,Normal组大鼠结肠黏膜结构完好,腺体排列规律完整。Model组黏膜层可见大量淋巴细胞,中性粒细胞浸润,黏膜各层结构不清,部分动物结肠可见散在溃疡点。DSS+60 mg/kg组以及DSS+SASP组大鼠结肠组织结构较清楚,炎性细胞浸润减轻,腺体结构清晰,排列较整齐,组织病理损伤评分明显低于模型组(P<0.05)。2五味子甲素抑制UC大鼠结肠IL-6、STAT3 m RNA的表达RT-PCR结果显示,与Normol组比较,Model组大鼠结肠组织中IL-6、STAT3 m RNA表达明显增加(P<0.05);与Model组比较,DSS+60 mg/kg组与DSS+SASP组IL-6、STAT3 m RNA的表达量明显降低(P<0.05)。说明五味子甲素能够下调IL-6、STAT3m RNA的表达。3五味子甲素抑制UC大鼠结肠IL-6、STAT3蛋白的表达ELISA实验结果发现,与Model组比较,除DSS+15 mg/kg组外,各给药组结肠组织MPO活性、IL-6含量显著下降,IL-13含量显著增加(P<0.05)。免疫组化法结果显示,DSS+SASP组,DSS+60 mg/kg组IL-6与STAT3蛋白表达显著减少,抑制STAT3蛋白磷酸化(P<0.05)。说明五味子甲素能抑制IL-6、p-STAT3、STAT3蛋白表达。结论:五味子甲素对DSS所致UC大鼠有缓解作用,可改善UC大鼠临床症状及病理损伤,抑制炎症因子表达,其机制可能是通过抑制IL-6/STAT3通路相关基因转录及蛋白表达,从而发挥UC治疗作用。