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目的:探讨体外原代培养的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（Rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS）中是否存在巨自噬与分子伴侣介导自噬（Chaperone-mediated autophagy,CMA）现象以及这些现象在类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）中的发病机制,并初步探讨异土木香内酯（Isochalactone,IATL）对RA-FLS增殖、凋亡及自噬的影响。方法:用Ⅱ型胶原酶消化RA患者的膝关节滑膜组织,培养原代RA-FLS,以骨关节炎（Osteoarthritis,OA）患者膝关节滑膜组织中培养的骨关节炎滑膜成纤维细胞（Osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes,OA-FLS）作为对照组,观察细胞形态,并进行传代培养,选取3～7代较纯且状态较好的细胞用于后续实验。1.采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基溴化四氮唑溴盐（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）检测RA-FLS与OA-FLS的细胞增殖活力;采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real time quantity polymerase chain reaction,RT-qPCR）、蛋白免疫印迹法（Western Blot）分别检测两组细胞中巨自噬标志性因子LC3、P62 mRNA及蛋白的相对表达水平。2.采用 RT-qPCR、Western Blot 法分别检测 RA-FLS 与 OA-FLS 中CMA代表性因子Hsc70、LAMP2A mRNA及蛋白的相对表达水平;采用免疫荧光法分别检测两组细胞中Hsc70、LAMP2A蛋白的共定位表达,进一步观察两组细胞中CMA的表达水平差异。3.加入最终质量浓度分别为0,6,12,24μmol/L的IATL干预RA-FLS 24h后,利用MTT检测RA-FLS细胞的增值活力;流式细胞仪检测不同浓度IATL处理下RA-FLS的细胞凋亡率;RT-qPCR、Western Blot法分别检测RA-FLS中巨自噬关键因子LC3、P62 mRNA及蛋白的相对表达水平;另以巨自噬晚期抑制剂-氯喹作为阳性对照组,使用mRFP-GFP-LC3双标腺病毒转染RA-FLS,在共聚焦显微镜下红、绿色斑点分别代表RFP、GFP标记的LC3蛋白,红绿荧光叠加后出现的黄色斑点为自噬体,仍保持红色的斑点为自噬溶酶体,由此观察氯喹对照组及不同浓度IATL处理后的实验组中自噬流进程;此外,采用RT-qPCR、Western Blot法分别检测RA-FLS中Hsc70、LAMP2A mRNA及蛋白的相对表达水平变化;免疫荧光法检测Hsc70、LAMP2A蛋白的共定位表达情况。结果:1.从患者膝关节滑膜组织中成功分离、培养出RA-FLS与OA-FLS,MTT结果显示RA-FLS的生长速度更快,细胞增殖活力明显强于OA-FLS;RT-qPCR、Western Blot 结果表明 RA-FLS 与 OA-FLS 相比,LC3 mRNA及蛋白的相对表达水平升高、P62 mRNA及蛋白的相对表达水平降低,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。2.RT-qPCR、Western Blot 结果显示与 OA-FLS 相比,RA-FLS 中Hsc70、LAMP2A mRNA及蛋白的相对表达水平均升高,两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）;利用TRITC-红色荧光、FITC-绿色荧光抗体分别标记Hsc70、LAMP2A蛋白后,共聚焦显微镜下可观察到RA-FLS中红色和绿色荧光明显比OA-FLS增强,代表Hsc70与LAMP2A蛋白共表达的黄色斑点（红绿荧光叠合）也显著增多。3.用不同浓度（0,6,12,24μmol/L）的IATL处理RA-FLS细胞24h后,MTT结果显示细胞增殖活力随药物浓度的升高而降低;流式细胞术检测结果显示,加药处理后的细胞凋亡率均增加,除IATL 6μmol/L组外,IATL 12μmol/L组、24μmol/L组的细胞凋亡率与对照组（5.61±0.11）%相比,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;巨自噬:RT-qPCR、Western Blot结果显示RA-FLS中LC3、P62 mRNA及蛋白的相对表达水平均升高,与未加药组相比,除IATL 6μmol/L组LC3蛋白外,组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）,mRFP-GFP-LC3腺病毒转染RA-FLS后共聚焦显微镜下可观察到,随着IATL浓度的增加,黄色斑点显著增多,而红色斑点减少,与阳性对照组-氯喹结果一致,表明在RA-FLS中巨自噬晚期进程受到抑制;CMA:RT-qPCR、Western Blot结果表明RA-FLS中Hsc70、LAMP2A mRNA及蛋白的相对表达水平均升高,与未加药组相比,IATL 24μmol/L组差异具有统计学意义（P＜0.05）,免疫荧光结果显示黄色斑点明显增多,Hsc70与LAMP2A的蛋白共定位表达增强。结论:1.与OA-FLS相比,RA-FLS的细胞增殖活力明显增强,巨自噬与CMA水平均显著升高;2.IATL以浓度依赖方式抑制RA-FLS细胞增殖、促进凋亡,通过阻滞自噬晚期进程来降低RA-FLS中巨自噬水平,并能抑制RA-FLS中CMA途径的激活,IATL可能通过自噬通路对RA产生治疗作用。