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研究背景:全球范围内,肺癌发病率及癌症相关死亡率均位居首位。肺癌主要以非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）为主,约占85%。尽管靶向药物已广泛应用于肺癌治疗,但对于无EGFR等突变的患者来说,铂类化疗药物如顺铂（Cisplatin,DDP）,依然为一线化疗药物。但大量临床实践表明,长期铂类化疗会导致肺癌耐药,最终化疗失败、肿瘤进展。因此,探寻安全有效的顺铂化疗增敏剂并探明其作用机制,对克服NSCLC顺铂耐药并改善临床治疗效果极为重要。YAP（Yes-associated protein）是控制组织器官大小的高保守Hippo信号通路的核心成员。研究表明,YAP在多种癌症中过表达,并与癌症干细胞自我更新、异常增殖、迁移侵袭以及预后不良相关,具有致癌基因作用。近来研究表明,YAP过度活化参与驱动铂类药物化疗耐药。抑制YAP可增强子宫颈癌、口腔鳞状细胞癌以及神经母细胞瘤对顺铂的敏感性。因此,靶向抑制YAP可能成为增强NSCLC顺铂化疗敏感性的潜在靶点。自噬（Autophagy）是将细胞内变性、衰老、受损的细胞器以及蛋白运送至溶酶体降解,并用以细胞循环再利用。正常情况下,自噬广泛存在于真核细胞中,对维持细胞稳态至关重要。在肿瘤发生发展过程中,自噬是一把双刃剑,可能促进肿瘤,也可能抑制肿瘤。近来研究表明,自噬可能是癌症化疗的保护机制,自噬抑制剂联合化疗药物抗肿瘤已成为新的研究热点。抑制自噬可增强肺癌、胃癌、结直肠癌以及卵巢癌对顺铂的敏感性。通过抑制自噬可能成为逆转NSCLC顺铂化疗耐药的潜在策略。维替泊芬（Verteporfin,VP）是由FDA批准的临床上用于治疗黄斑变性的第二代卟啉类光敏剂。最近研究表明,VP在抗肿瘤、逆转肿瘤耐药方面发挥着重要作用:VP直接抑制YAP表达,进而抑制卵巢癌增殖、膀胱癌侵袭转移、诱导胰腺癌细胞凋亡以及增强尿路上皮细胞癌细胞对顺铂的敏感性;VP通过抑制自噬增强胰腺导管腺癌对吉西他滨的敏感性;VP通过损伤溶酶体,阻断自噬流,增强肝细胞癌对索拉非尼的敏感性;此外,VP在结直肠癌中诱导p62形成寡聚体,而肿瘤细胞对高分子寡聚蛋白清除障碍,导致其具有肿瘤选择性蛋白毒性。那么,VP是否能增强肺癌铂类耐药细胞A549/DDP对顺铂的敏感性呢?其是否通过抑制YAP以及自噬实现逆转NSCLC顺铂耐药呢?因此,本研究旨在探讨VP对NSCLC A549/DDP细胞顺铂耐药性影响及其可能的分子机制,以期为维替泊芬作为非小细胞肺癌顺铂化疗增敏剂运用于临床提供实验室依据。研究目的:1.明确维替泊芬增强肺癌铂类耐药细胞A549/DDP顺铂敏感性的作用;2.探讨维替泊芬增强A549/DDP细胞顺铂化疗敏感性的潜在机制。研究方法:1.利用MTS、Western Blot、Real-time PCR检测维替泊芬联合顺铂处理A549/DDP细胞后,细胞增殖、凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP以及促凋亡基因PUMA、BIM的变化;2.利用细胞划痕、Transwell实验检测维替泊芬及顺铂处理A549/DDP细胞后,细胞迁移、侵袭能力的变化;3.Western Blot检测维替泊芬处理A549/DDP细胞后EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail 表达变化;4.Western Blot检测维替泊芬处理A549/DDP细胞后转运蛋白ABCG2、ABCG5表达变化。5.Western Blot检测A549、A549/DDP细胞中YAP蛋白的表达;维替泊芬处理A549/DDP细胞后YAP蛋白的表达变化;构建慢病毒感染稳定敲减YAP基因的A549/DDP细胞（A549/DDP-shYAP）;分别应用Real-time PCR、Western Blot以及细胞免疫荧光检测shYAP对A549/DDP细胞中YAP的敲减效率;6.利用MTS、流式细胞仪检测A549/DDP-shYAP细胞顺铂处理后,细胞增殖、凋亡的变化;7.利用细胞划痕、Transwell实验检测A549/DDP-shYAP细胞顺铂处理后,细胞迁移、侵袭能力的变化;8.瞬转 pYAP 质粒在 A549 中过表达 YAP（A549-YAP）,Western Blot验证过表达效果;9.Western Blot检测A549以及A549/DDP细胞EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail表达情况;分别检测A549细胞过表达YAP前后以及A549/DDP细胞敲减YAP前后EMT相关蛋白表达变化;10.Western Blot 检测 A549 以及 A549/DDP 细胞转运蛋白 ABCG2、ABCG5表达情况;分别检测A549细胞过表达YAP前后以及A549/DDP细胞敲减YAP前后转运蛋白表达变化。11.转染GFP-LC3质粒后,应用共聚焦显微镜观察维替泊芬及顺铂处理A549/DDP细胞后LC3-GFP斑点数量;Western Blot检测维替泊芬及顺铂处理A549/DDP细胞后自噬相关蛋白LC3、p62以及Ub的表达变化。研究结果:1.与单独顺铂处理相比,维替泊芬联合顺铂可显著抑制细胞增殖（P＜0.05）,上调 Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP 蛋白以及 PUMA、BIM mRNA（P＜0.05）的表达;2.维替泊芬联合顺铂较单独顺铂处理显著抑制细胞迁移（P＜0.05）、侵袭能力;3.Western Blot结果显示维替泊芬处理A549/DDP细胞后,E-cadherin表达显著升高,Vimentin以及Snail表达明显减少;4.Western Blot结果显示维替泊芬处理A549/DDP细胞后,ABCG2、ABCG5表达明显减少。5.YAP在A549/DDP细胞中高表达（P＜0.05）;维替泊芬明显抑制A549/DDP 细胞中YAP 蛋白的表达;Real-time PCR、Western Blot 以及细胞免疫荧光结果显示shYAP能有效抑制A549/DDP细胞YAP mRNA（P＜0.05）以及蛋白的表达;6.敲低YAP促进顺铂诱导的凋亡（P＜0.05）;7.敲低YAP增加顺铂的迁移（P＜0.05）、侵袭抑制作用;8.Western Blot结果显示pYAP过表达质粒能有效上调A549细胞中YAP蛋白的表达;9.与A549细胞相比,A549/DDP细胞中E-cadherin显著低表达,Vimentin、Snail明显高表达;A549细胞过表达YAP后E-cadherin表达降低,Snail表达升高;A549/DDP细胞敲低YAP后E-cadherin表达升高,Vimentin表达降低;10.与A549细胞相比,A549/DDP细胞中ABCG2、ABCG5明显高表达;A549细胞过表达YAP后ABCG2、ABCG5表达均升高;A549/DDP细胞敲低YAP后ABCG2、ABCG5表达均降低。11.顺铂促进A549/DDP细胞自噬体形成,维替泊芬联合顺铂处理后自噬体形成明显减少;Western Blot结果显示A549/DDP细胞顺铂处理后LC3表达增加,维替泊芬处理后LC3、P62以及Ub表达增加,并观察到高分子P62寡聚体的形成。研究结论:1.维替泊芬可通过抑制增殖、迁移、侵袭以及促进凋亡增强A549/DDP细胞顺铂化疗敏感性;2.维替泊芬可能通过抑制YAP以及自噬增强A549/DDP细胞顺铂化疗敏感性;3.维替泊芬可能作为临床治疗非小细胞肺癌顺铂耐药的潜在化疗增敏剂,调节YAP以及自噬可能是逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的新策略。