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研究背景和目的:寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒。2015年在巴西地区发生了大规模的爆发,且研究发现孕期寨卡病毒感染与新生儿小头畸形的发生有关,由于目前尚无特异性的治疗药物以及疫苗,因此受到了世界卫生组织的重视。虽然国内外很多课题组致力于寨卡病毒的致病机制的研究并取得了很多进展,但是具体的致病机制目前仍不十分清楚。当机体受到病毒感染时,人体的天然免疫系统通过释放干扰素(Interferons,IFNs)抵御抗病毒,发挥第一道防线作用。而干扰素β作为最早产生的I型干扰素,除了刺激产生干扰素刺激基因(Interferon Stimulated Genes,ISGs)来发挥抑制病毒的作用,还可以作为细胞因子调节自然杀伤细胞(Nature Killer cells,NK cells)对靶细胞(肿瘤细胞、病毒感染宿主细胞等)的杀伤能力。人体几乎所有细胞均可以产生并释放外泌体(exosomes),并且外泌体作为载体在细胞之间发挥着细胞信号传递的作用。当细胞受到外界刺激后,其产生的外泌体内容物也会发生变化。外泌体可以携带病毒的RNA/蛋白在细胞间传递,从而发挥促进病毒传播或影响疾病进程的作用;外泌体也可以携带某些抗病毒物质进入宿主细胞传递其抗病毒作用。本研究聚焦外泌体在寨卡病毒感染中的作用,旨在于发现寨卡病毒感染宿主细胞后产生的外泌体对寨卡病毒感染进程的影响,以及干扰素β诱导产生的外泌体以何种方式增强NK细胞杀伤寨卡病毒感染细胞的作用。实验方法:1.通过差速离心法结合蔗糖密度梯度离心法,从寨卡病毒感染前后A549细胞的细胞培养上清中提取纯化外泌体,使用人逆转录组芯(Human Transcriptome Array,HTA)对提取外泌体内的RNAs表达进行高通量检测,根据生物信息学分析筛选出可能参与寨卡病毒致病过程的基因,通过对筛选基因的过表达,real-time PCR、western blot、ELISA、流式细胞术等分子生物学方法检测,对ZIKV复制情况、细胞增殖的影响及其机制进行研究。2.通过差速离心法结合蔗糖密度梯度离心,从干扰素β处理前后A549细胞的培养上清中提取纯化外泌体,使用人逆转录组芯片(Human Transcriptome Array,HTA)对外泌体内RNAs表达进行高通量检测,生物信息学筛选干扰素β诱导产生外泌体内表达明显变化的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA),通过亚细胞定位、qPCR、western blot、ELISA、双荧光酶报告基因等方法检测筛选出的lncRNA对NK细胞杀伤能力的影响及其发挥作用的分子机制。结果:1.通过人逆转录组芯片(HTA)及生物信息学分析,我们发现防御素α 1B(definsin α 1B,DEFA1B)在寨卡病毒诱导产生的外泌体内表达增高。通过对DEFA1B的高表达我们发现DEFA1B可作为分泌蛋白在寨卡病毒进入细胞前发挥抑制作用。同时我们发现细胞内的DEFA1B通过与起始识别复合体亚基1(Origin recognition complex subunit 1,ORC1)在细胞质中相互结合减少ORC1进入细胞核,进而对细胞周期产生抑制作用,使细胞增殖减慢。进一步研究发现,外泌体作为载体可以传递DEFA1B对细胞周期的抑制作用。2.干扰素β诱导产生的外泌体与NK细胞共培养48小时后,NK细胞的杀伤能力明显增强。通过对外泌体核酸进行逆转录组芯片检测及生物信息学分析,我们筛选出一个主要表达在细胞浆中的lncRNA(linc-EPHA6-1),其可以通过海绵吸附作用吸附miR-4485-5p;进一步研究发现,NK细胞活化受体NKp46是miR-4485-5p的一个靶基因,linc-EPHA6-1通过海绵吸附作用竞争性结合miR-4485-5p,从而使miR-4485-5p的靶基因NKp46表达上升,进而增强NK细胞的杀伤能力。结论:寨卡病毒感染诱导产生的外泌体内DEFA1B抑制寨卡病毒入胞。DEFA1B可以通过与ORC1相互作用,降低细胞核内ORC1的量来抑制细胞周期的进程,从而导致细胞增殖减慢,并且此作用可以通过外泌体传递。干扰素β诱导产生的外泌体内的linc-EPHA6-1可以通过竞争吸附miR-4485-5p进而使其靶基因NK细胞活化受体NKp46的表达水平增加,从而提高NK细胞的自然杀伤活性。综上所述,寨卡病毒诱导产生的外泌体可以通过DEFA1B对细胞增殖产生抑制作用。如果发生在胚胎发育早期,是否与胎儿小头畸形的发生有关有待于进一步研究。干扰素β作为天然免疫的第一道防线,其诱导产生的外泌体内linc-EPHA6-1可以通过海绵吸附结合miR-4485-5p,增强NK细胞的杀伤能力,揭示了干扰素β调控NK细胞活性的一条新路径。