论文部分内容阅读
背景和目的狼疮肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)最常见的并发症之一,且LN的严重程度对SLE患者死亡率及预期寿命有显著影响。目前为止LN的病因和发病机制尚未明确阐明。目前越来越多的研究报道Toll样受体/白细胞介素-1受体(TLR/IL-1R)信号通路参与SLE的发病机制。单一免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR),又称为Toll/interleukin-1受体8(TIR8),是TLR/IL-1R家族的成员,越来越多的证据表明SIGIRR对TLR/IL-1R信号通路具有负调控作用,并有可能成为SLE治疗的潜在靶点,但是何种机制调控SIGIRR的表达,目前还不清楚。核转录因子NF-κB(NF-κB)是一类功能广泛的核转录调控元件,被激活后可以调控多种基因的转录和翻译。在LN等免疫介导的肾脏疾病中TLR/IL-1R-NF-κB过度活化,参与调控炎性介质及细胞因子的产生。临床上很多药物的作用机制也是干预NF-κB的活化而控制疾病的发展。因此我们将在人肾小管上皮细胞内探讨SIGIRR可以调控NF-κB(p65)的过度活化和活化的NF-κB(p65)是否反过来又可以调控SIGIRR的表达,控制自我的过度活化使免疫保持平衡。另外在LN等慢性肾脏疾病进展至终末肾功能衰竭的进程中肾间质纤维化(RIF)发挥着重要作用,其中肾小管上皮-间充质细胞转分化(EMT),也称为肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转化,是RIF发生的关键事件。研究发现LN患者肾脏组织中过度表达活化的白介素lβ(IL-1β)可以通过TLR/IL-1R信号通路诱导肾小管上皮细胞转化为肌成纤维细胞,在RIF的形成中发挥重要作用,而SIGIRR对该信号通路具有负调控作用,因此我们将探讨是否SIGIRR可以经TLR/IL-1R-NF-κB信号通路阻断IL-1β诱导的信号活化而改善人肾小管上皮细胞的转分化的发生。方法第一部分:针对SIGIRR基因的有效靶点设计sh RNA序列,与GV248-GFP-Puro慢病毒载体连接产生重组体(GV248-GFP-Puro-sh SIGIRR)。将测序验证正确的重组体与包装质粒(p MDL、p Rev和p VSVG)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒并感染HKC细胞。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和western blot法分析检测HKC细胞中SIGIRR干涉效率。应用IL-1β刺激成功敲低SIGIRR的HKC细胞及对照细胞,western blot检测其下游核转录因子NF-κB(p65)的磷酸化水平,荧光定量PCR分析单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和正常T细胞表达和分泌的活化调节蛋白(RANTES)m RNA水平。第二部分:该部分研究以野生型HKC为模型,构建p65稳定下调的HKC细胞系(HKC/shp65),经逆转录PCR(RT-PCR)、western blot和免疫荧光法检测SIGIRR表达情况。在线预测SIGIRR启动子区域NF-κB(p65)的结合位点,以野生型HKC细胞为模版,染色质免疫沉淀技术(Ch IP)初步验证NF-κB(p65)可以结合至SIGIRR启动子区域。提取人全基因组DNA,PCR方法调取SIGIRR启动子序列连接至p GL3-Basic荧光素酶报告基因载体上。酶切和测序验证成功构建,之后把NF-κB(p65)与SIGIRR启动子DNA结合的序列进行定点突变构建突变载体并测序验证,再经荧光素酶报告基因实验间接的进一步验证NF-κB(p65)可结合调控SIGIRR的表达。第三部分:将人SIGIRR c DNA片段连接至逆转录病毒载体p LNCX2-G418,经PT67细胞包装成病毒感染HKC细胞,q RT-PCR和western blot证实SIGIRR过表达HKC细胞(HKC/SIGIRR)成功构建。HKC/SIGIRR细胞及对照细胞经IL-1β诱导后,倒置显微镜下观察细胞形态,western blot和免疫荧光检测EMT相关的分子标记(E-cadherin和Vimentin)变化,划痕实验和Transwell assay检测细胞迁移能力。提取核蛋白后western blot检测NF-κB(p-p65)表达,q RT-PCR法检测转化生长因子-β(transforming growthfactor-β,TGF-β)m RNA表达。结果第一部分:成功构建重组慢病毒载体GV248-GFP-Puro-sh SIGIRR。q RT-PCR和western blot均证实在HKC细胞中成功敲低SIGIRR的表达。此外,IL-1β刺激后,与对照细胞相比,敲低SIGIRR的HKC细胞(HKC/sh SIGIRR)的p65磷酸化水平上调,MCP-1和RANTES m RNA表达水平升高。第二部分:成功构建p65稳定干涉的HKC细胞(HKC/shp65),并发现干涉p65基因后,SIGIRR蛋白表达量下调。在线预测发现在SIGIRR启动子上游存在p65的结合位点。CHIP方法证实p65可以结合在SIGIRR启动子区。成功构建p GL3-SIGIRR-Luc和突变载体,经荧光素酶实验再次证明p65可以结合至SIGIRR启动子区并可以调控表达。第三部分:成功构建p LNCX2-G418-SIGIRR过表达载体,q RT-PCR和western blot均证实在HKC细胞中SIGIRR成功过表达。此外发现与SIGIRR过表达组相比较,经IL-1β诱导后对照组细胞呈梭形改变,上皮细胞标记分子上皮型钙黏蛋白E-cadherin表达减弱,间充质细胞标记分子波形纤维蛋白Vimentin表达增强,细胞的迁移能力亦增强。发现该作用是通过SIGIRR影响IL-1β诱导的TLR/IL-1R-NF-κB信号通路的激活减少TGF-β的产生实现的。结论第一部分实验结果提示SIGIRR可对IL-1β诱导的人肾小管上皮细胞内TLR/IL-1R信号通路活化起到“刹车”作用,并且在第二部分发现TLR/IL-1R信号通路下游靶分子NF-κB(p65),活化后可反过来调控SIGIRR的表达而达到免疫平衡。在第三部分中发现SIGIRR作为一抑制分子,可以经TLR/IL-1R-NF-κB信号通路调控IL-1β诱导的人肾小管上皮细胞的转分化。