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目的:探究自噬相关基因Atg7对NSCs增殖及分化潜能的影响,旨在寻找影响NSCs增殖活力及分化能力的关键靶点,为治疗神经退行性疾病提供新的可行性策略。方法:1.设计合成靶向Atg7的siRNA序列及其对照siRNA,电穿孔法分别转染NSCs,转染48h后提取NSCs总的RNA,72h后提取NSCs全蛋白,运用Real-time PCR及Western blot分别从m RNA水平和蛋白水平测定Atg7基因的敲减效率。2.应用Western blot比较si RNA组与对照组siRNA的LC3II以及P62的表达变化,检测敲减Atg7对NSCs自噬水平的影响。3.测量神经球的数量和平均直径,运用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入实验检测Atg7基因沉默对NSCs增殖能力的影响。4.利用Tuj1和GFAP免疫荧光染色分析Atg7基因敲减对NSCs分化能力的影响。5.应用SA-β-gal染色检测siRNA组与对照组si RNA衰老细胞阳性率,qPCR分析P16、P21、P27和P53衰老相关基因的转录情况。结果:1.RT-PCR结果显示siRNA组Atg7 mRNA水平亦较对照组显著降低54%(P<0.001),但Atg3,Atg5,Beclin1自噬其他相关基因的mRNA水平无显著变化;Western blot显示,Atg7敲减组的蛋白表达水平较对照组降低35%(P<0.01),提示siRNA干扰能够显著降低NSCs Atg7的表达水平。2.Western blot结果显示,siRNA组LC3II蛋白水平较对照组降低27.5%(P<0.05),P62蛋白水平为对照组的1.5倍(P<0.001),提示敲减Atg7基因后,能够降低NSCs的自噬水平。3.si RNA组神经球的数目较对照组降低20%(P<0.01)而且平均直径下降30%(P<0.01);BrdU免疫荧光染色实验结果显示si RNA组BrdU阳性率较对照组显著下降29.8%(P<0.001),提示Atg7基因敲减可以抑制NSCs的增殖的能力。4.Tuj1和GFAP免疫荧光染色显示,Atg7-siRNA实验组Tuj1阳性细胞率较对照组显著降低38.3%(P<0.05),而其GFAP阳性细胞率为对照组的1.8倍(P<0.01)。提示Atg7基因沉默可以抑制NSCs向神经元方向分化的能力。5.SA-β-gal染色结果显示siRNA组中衰老阳性细胞数是对照组的2.8倍(P<0.001),P16、P21、P53的m RNA表达水平分别为对照组的1.5(P<0.05)、1.6(P<0.05)、1.6(P<0.001)倍,而P27的mRNA表达水平无明显变化,提示下调Atg7表达水平可能激活衰老相关基因转录,导致NSCs活力降低。结论:1.Atg7敲减能够显著抑制NSCs增殖与分化能力。2.Atg7敲减能够下调NSCs自噬水平,降低NSCs活力,提示自噬在维持NSCs功能中发挥重要作用。