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镉(Cd)是一种毒性较强的环境污染物,近年来,由于采矿等工业活动,Cd被释放到土壤和水体当中,导致较多被Cd污染的土地无法得以正常利用。Cd不仅会通过土壤进入植物系统影响植物的生长发育,还会通过食物链威胁人类健康。植物修复是土壤Cd污染的重要修复方式,通过基因工程构建优质高效植物体是突破野生植物限制的重要途径。因此,明确植物调控Cd污染机制,培育新的抗Cd植物品种将变极为重要。构树(Broussonetiapapyrifera)被认为是重金属污染土壤修复的重要候选植物,尽管已经开展许多生理生化相关的研究,证明构树对Cd具有较强耐受性,但构树抗Cd分子机制尚不明确。转录调控是植物逆境应答的重要分子机制,为了应对环境胁迫的挑战,植物细胞激活了几种信号通路,并触发转录因子(TFs)的表达。MYB蛋白是植物TFs中最大的家族之一,对植物具有特异性,参与调控植物细胞发育、次生代谢以及对环境胁迫的反应。本研究对响应Cd胁迫的R2R3-MYB家族基因BpTT2进行过表达,采用基因工程手段通过农杆菌介导法将其转入野生型构树(WT),获得了BpTT2过表达构树株系。通过自然生长条件下(CK)以及500 μmol/L CdCl2胁迫下的盆栽实验,解析转基因构树参与的生理生化进程和Cd富集情况,验证BpTT2基因的抗Cd功能。进一步利用转录组测序技术(RNA-Seq)筛选Cd胁迫下BpTT2调控的下游基因及代谢途径,并结合qRT-PCR分析相关基因在Cd胁迫下的表达调控机制,阐述了BpTT2基因的抗Cd分子功能。主要研究结果如下:(1)采集不同来源构树种子,选取长、宽和千粒重均最大的优良种质资源进行种子萌发,并对幼芽通过植物组织培养获得大量构树组培苗。利用农杆菌介导法将含有过表达BpTT2的植物表达载体和空质粒pROKII载体导入构树叶片和茎段,通过共培养、脱菌、抗性芽筛选等获得BpTT2过表达构树株系,qRT-PCR验证显示BpTT2过表达构树株系中BpTT2基因表达量均显著高于WT和转空载体pROKII构树,其中相对表达量最高的转基因构树株系是WT的7.22倍。(2)盆栽实验证实了BpTT2过表达构树的抗Cd功能,即在500 μmol/L的CdCl2胁迫下处理三个月,BpTT2过表达构树幼苗的株高、生物量、可溶性蛋白含量、叶绿素a和总叶绿素含量均显著高于WT和转pROKII构树株系(P<0.001);同时,在非转化株系中检测出较多与ROS积累相关的物质,如MDA和H2O2。Cd胁迫还降低了非转化构树叶片的气孔导度Gs,影响CO2的吸收,进而抑制光合作用。而SOD、POD和CAT三个抗氧化酶活性在非转化株系构树中显著升高(P<0.01),体现出其清除较多的ROS而呈现出的活跃状态。总之,从生理生化特性上,BpTT2过表达构树通过调节渗透压、减少ROS积累从而免受Cd胁迫产生的氧化应激。(3)对三个株系构树在CK和Cd胁迫下重金属Cd的富集情况分析,结果显示:在CK条件下土壤、根、茎、叶中Cd含量、转运系数(TF)和生物富集系数(BCF)在三个株系中无显著性差异(P>0.05)。而在Cd胁迫下,WT株系中Cd的富集量最多,BCF为3.41±0.72;BpTT2过表达构树株系中Cd富集量最少,BCF为1.52±0.05,显著低于非转化株系(P<0.05)。Cd在构树组织内富集为:根>茎>叶,且土壤中剩余Cd含量在BpTT2过表达构树株系中显著升高(P>0.05)。表明BpTT2的过表达主要通过将多余的Cd2+阻止在土壤和根部,避免较多的Cd进入细胞内抑制生长发育。(4)对Cd胁迫下BpTT2过表达构树和WT野生型构树的幼苗叶片进行了转录组比较分析。在WT-Cd vs BpTT2-Cd 比较组中共筛选获得了 2626个DEGs表达差异显著(q-value<0.05),而且超过3/4的基因属于上调表达。GO功能注释显示这些DEGs主要参与“细胞壁大分子分解过程”和“膜的组成部分”。KEGG富集分析表明,大量与Cd胁迫响应相关的基因显著富集在“植物病原菌互作”、“MAPK信号途径-植物”、“植物激素信号转导”和“类黄酮生物合成”代谢途径中。其中ABA信号转导基因SNRK2和PP2C同时参与调控“MAPK信号途径”和“植物病原菌互作”。许多TFs基因也被诱导上调表达,包括WRKY类TFs基因WRKY29、WRKY33,AP2/ERF 类 TFs 基因ERF1和 bHLH 类 TFs 基因 MYC2,这些基因也同时调控多个信号级联,增强BpTT2过表达构树对Cd胁迫的防御能力。(5)通过qRT-PCR验证了BpTT2过表达诱导的部分下游代表性基因,结果证实了转录组测序结果的可靠性。其中植物激素AUX/IAA信号转导基因ARF5和ABA信号转导基因PP2C和SNRK2、蛋白激酶相关基因(PHOT1、WAKL4、PK1和MPK3)、ROS积累相关基因(RbohD和CAT1)、以及大量对Cd胁迫高度敏感的TFs家族基因(WRKY33、WRKY29、MYB2、MYB4、ERF1、ABR1、CRF4和MYC2),在Cd胁迫下的BpTT2过表达构树叶片中均显著上调表达(P<0.01);而谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因GSTU22和GSTL3,主要通过抑制表达行使功能。这些基因在相同蛋白家族中调控Cd胁迫具有一致性,不仅参与调控植物信号转导途径,而且参与清除ROS,对H2O2信号作出反馈调节。本研究筛选和鉴定的与Cd富集和耐受相关的候选基因是利用基因工程进行植物修复的前提,结果阐明了BpTT2过表达构树在Cd胁迫下参与调控的基本生物学功能以及分子调控机制,特别是为后续MYB蛋白的功能研究提供了重要的基因组资源,转基因构树的田间试验将有助于未来的植物修复应用。