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茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)与菰草(Zizania latifolia)互作在其上部产生膨大结构,称为茭白。茭白是一种重要的水生蔬菜。茭白黑粉菌以菌丝体的形式长期存活在寄主体内,通过寄主的无性繁殖转移到新的植株中,具有独特的生活史。有时,膨大的组织内产生大量的冬孢子堆,称为灰茭。虽然冬孢子可以萌发产生担孢子,但大量的观察认为不同交配型的担孢子不能融合产生双核菌丝,因而不能侵染寄主。研究认为,担孢子可融合为双核菌丝,但还没有充分的证据证实。因此,本文通过大量的担孢子株系交配基因的测定以及人工合成交配基因编码的蛋白,评价其功能作用。1.茭白黑粉菌的交配型基因表达分析。利用local blast在对茭白黑粉菌6条MFA基因和3条PRA基因表达分析后,发现关于交配型的基因全部表达,但在浙茭2号中,茭白黑粉菌只含有a2位点单倍体和a3位点单倍体,灰茭黑粉菌只含有a1位点和a3位点单倍体,PRA的基因类型可以作为浙茭2号交配型的鉴定依据。2.真菌分离及交配型基因的测定。通过浙茭2号灰茭组织分离,获得6个株系。通过冬孢子萌发产生担孢子及其单孢分离,获得50个株系。同样,通过浙茭2号茭白组织分离,获得4个株系。逆境诱导茭白产生冬孢子后,通过冬孢子萌发产生担孢子及其单孢分离,获得42个株系。通过PCR方法对每个株系的交配型基因检测,结果显示,分离自灰茭的50个株系中含有交配型基因a1(MFA1.2-PRA1-MFA1.3)位点的株系有5个,含有a3(MFA3.2-PRA3-MFA3.1)位点的株系有45个,比率为1/9(a1/a3);同样,6个组织分离系含有a1(MFA1.2-PRA1-MFA1.3)位点和a3(MFA3.2-PRA3-MFA3.1)位点。分离自茭白的42个株系中含有交配型基因a2(MFA2.3-PRA2-MFA2.1)位点的株系有5个,包含a3(MFA3.2-PRA3-MFA2.1)位点的株系有37个,比率为1/7.2(a2/a3);4个组织分离系含有a2(MFA2.3-PRA2-MFA2.1)位点和a3(MFA3.2-PRA3-MFA3.1)位点。依据PCR检测结果,选取来自灰茭的8个担孢子株系共组成16个不同交配基因型组合(a1和a3)进行十字交叉法测定,结果表明,所有组合都未观察到菌丝体产生。选取来自灰茭含有不同交配型基因的10个担孢子株系(5(a1)和5(a3))构成25个组合进行孢子滴定测定,同样用来自的茭白的10个担孢子株系(a2和a3)组成25个组合进行孢子滴定测定,结果表明,所有组合都未观察到菌丝体产生,这与田间多年观察到的结果一致。3.人工合成信息素氨基酸序列活性试验。通过基因比对分析茭白黑粉菌与丝孢堆黑粉菌交配型基因同源性最高。依据信息素基因,人工合成了修饰的多肽信息素(均为17个氨基酸)和蛋白信息素(含有38个氨基酸和40个氨基酸)。用4个含有不同交配型担孢子株系构成4个组合H9(a1)×H10(a3)、H9(a1)×J4(a3)、H10(a3)×J24(a2)、J4(a3)×J24(a2)进行孢子滴定,然后滴加2种多肽信息素进行测定。用4个同样组合滴加2种蛋白信息素进行测定。结果显示,多肽信息素有促进效果,但不明显,蛋白信息素促进效果明显,促进产生类似于菌丝的绒毛状物质。然而,显微镜观察发现,这些绒毛状物质是担孢子。DAPI染色结果显示,绒毛状物质含有单核。这表明,茭白黑粉菌关于交配的基因功能已经完全丧失。