[背景与目的]冠状动脉钙化（coronary artery calcification,CAC）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者急性心血管事件发生的独立危险因素。主要表现为血管壁钙磷沉积,血管顺应性降低,僵硬度增加。其中,在动脉硬化的血管中,内膜发生钙化较早,促发和加重血管硬化的进程,极大地增加了糖尿病患者死亡的风险。研究认为,血管钙化是类似于骨发育的可被多种致病因素调控的病理生理过程,血管细胞向成骨样细胞转化是血管钙化发生的重要环节。近期发现,内皮细胞可通过内皮-间充质转化（endothelial-mesenchymal transition,End MT）获得成骨分化潜能,但其具体调控机制尚不明确。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修饰是mRNA上最主要的甲基化修饰之一,参与mRNA的表达调控。甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like3,METTL3）是m6A修饰过程中最重要的甲基化转移酶,其表达异常与恶性肿瘤、胚胎发育迟缓、干细胞分化异常等多种疾病的发生发展密切相关。最新研究显示,METTL3的表达受血糖的动态调控,在2型糖尿病患者中表达明显升高。本课题组前期发现,METTL3在糖尿病患者血管钙化病变中呈高表达;且高糖可上调人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells,HCACEs）METTL3的表达,并促进整体m6A修饰水平。此外,研究发现,METTL3能促进内皮细胞向造血细胞转变。鉴于METTL3的这种特性,本课题组前期敲低METTL3的表达,发现End MT被抑制;提示,METTL3介导的m6A修饰可能通过促进End MT从而参与糖尿病血管内皮损伤和冠脉钙化,但其具体作用和机制尚有待阐明。因此,本课题探究了METTL3介导的m6A修饰通过End MT调控血管内皮细胞钙化进程的具体机制。本项目有望从RNA甲基化修饰角度揭示糖尿病冠脉钙化的新机制,为糖尿病血管病变的防治提供新思路。[方法]首先,在临床样本中取人血管钙化组织做石蜡切片,通过HE染色、Alizarin Red S染色、von Kossa钙化染色检测血管钙化情况;免疫组化染色检测钙化组织内METTL3的表达,免疫荧光染色检测METTL3与内皮标志物和平滑肌细胞标志的共定位情况,观察METTL3与细胞钙化的关系;其次,培养HCACEs,予以高糖处理,通过免疫印迹实验（western blot,WB）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、比色法检测HCACEs内METTL3的表达及整体m6A水平,并进行m6A RNA甲基化测序（MeRIP-seq）;采用慢病毒转染构建METTL3敲低稳转株,在高糖以及成骨分化介质的诱导下,采用WB、qRT-PCR以及免疫荧光染色检测细胞中METTL3,间充质细胞标志物-波形蛋白（Vimentin）,平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,内皮细胞标志物-血管内皮钙粘蛋白（vascular endothelial cadherin,VE-cadherin）,血小板-内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31）,成骨分化标志物-骨桥蛋白（osteopontin,OPN）的表达;通过比色法检测细胞内钙离子含量,茜素红染色检测钙盐沉积;并利用GO、KEGG、IGV可视化分析等方法筛选m6A peak富集的通路及相关靶基因;最后,通过MeRIP-qPCR、RNA免疫沉淀（RIP）、RNA pull down等实验进行机制分析。[结果]METTL3在人血管钙化斑块中呈高表达,并与内皮细胞存在共定位;HCACEs经高糖诱导后,METTL3的表达及整体m6A修饰水平显著上升;MeRIP-seq结果显示,细胞分化、成骨分化相关通路基因的m6A修饰水平发生富集,并且细胞分化相关因子CREB转录激活因子1（CRTC1）mRNA上检测到明显的m6A peak;在METTL3敲低稳转株上,采用高糖以及成骨分化介质处理后,内皮间质转化及钙化水平被抑制,且细胞内CRTC1 mRNA的m6A水平及蛋白水平下降;减低CRTC1再过表达METTL3,内皮间质转化及钙化水平无法进一步被促进;具体机制研究显示YTHDF1通过识别CRTC1 mRNA上的m6A修饰位点来增强CRTC1翻译,从而参与糖尿病冠脉钙化的进展。[结论]:1.METTL3通过调控CRTC1-mRNA-m6A修饰,上调CRTC1表达,促进End MT,参与糖尿病冠脉钙化;2.m6A阅读器YTHDF1通过识别CRTC1 mRNA上的m6A修饰位点来增强CRTC1翻译。