从土壤中分离的生防菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),试验证明它对6种植物病原真菌具有较好的抑制作用。为了进一步研究利用该生防菌,本文研究了不同饱和度硫酸铵提取的枯草芽孢杆菌粗蛋白的抑菌作用和抑菌机理,并通过PAGE电泳技术纯化粗蛋白,并对纯化蛋白进行了初步研究。结果如下:1.枯草芽孢杆菌发酵液、菌悬液和无菌滤液对的6种病原真菌都有抑制作用,并且枯草芽孢杆菌发酵液和无菌滤液对6种病原真菌的抑制率均在60%以上。2.通过测分光光度值得知,枯草芽孢杆菌在42 h后达到生长的稳定期,42h以后为为枯草芽孢杆菌生长的衰退期,所以,当枯草芽孢杆菌振荡培养42 h时,适合提取粗蛋白。3.枯草芽孢杆菌粗蛋白对6种病原真菌均有抑制作用。不同饱和度硫酸铵提取的粗蛋白对不同病原真菌的抑制效果不同,并且枯草芽孢杆菌胞外粗蛋白比胞内粗蛋白的抑菌效果稳定。枯草芽孢杆菌粗蛋白不仅对苹果炭疽病菌菌丝有明显的破坏作用,使菌丝细胞畸形膨大、扭曲。而且可以抑制苹果炭疽病菌分生孢子萌发和芽管伸长。当硫酸铵饱和度为20-40%时,胞外抗菌蛋白浓度为0.11mg/mL时,对病菌分生孢子的萌发率仅为30.56%,芽管伸长的长度为38.72μm;当硫酸铵饱和度为40-60%时,胞内蛋白浓度为0.11mg/mL时,对病菌分生孢子的萌发率为62.34%,芽管伸长的长度为41.09μm。总体上看,胞外粗提蛋白对病菌分生孢子的萌发和芽管伸长的抑制作用强于胞内蛋白。4.枯草芽孢杆菌胞外粗蛋白的热稳定性比胞内粗蛋白的抑菌效果好,并且随着温度的升高抑菌率逐渐降低,当温度为80℃时,胞外蛋白虽然能有抑菌效果,但是,抑菌率很低仅为10.19%,胞内蛋白的抑菌率仅为7.10%,当温度为100℃时,粗蛋白均没有抑菌活性。粗蛋白的抑菌效果受酸碱度影响不明显。枯草芽孢杆菌粗蛋白经胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K处理后,抑菌率与对照组的粗蛋白的抑菌率差异显著(P=0.05)。对于胞外粗蛋白,胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K处理后的的抑菌率分别为对照的74.36%、58.87%、43.96%;对于胞内粗蛋白,胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K处理后的的抑菌率分别为对照的40.88%、35.67%、45.94%。试验结果说明,该粗蛋白提取液中抗菌物质为混合成分,其中含有一部分蛋白类物质。5.选取硫酸铵饱和度为20-40%的胞外粗提蛋白和硫酸铵饱和度为40-60%的胞内粗提蛋白做室内活体试验,结果表明:先蛋白处理后接种试验中,在不稀释的情况下,胞外蛋白对苹果炭疽病防效可达100%,当稀释10倍以后,防效仍为61.9%;胞内蛋白防效为41.38%;在先接种后蛋白处理的试验中,胞外蛋白的防效为55%,胞内蛋白的防效为29.17%。由试验结果显示:胞外粗提蛋白的防效比胞内粗提蛋白好,从结果还可以推知,粗提蛋白对苹果炭疽病主要是保护作用。防治小麦赤霉病的田间试验表明,枯草芽孢杆菌粗蛋白对小麦赤霉病有防治作用。6.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条带显示,该粗提蛋白含有6种蛋白。抑菌结果表明,只有第6个条带具有抑菌作用。该抑菌蛋白对小麦赤霉病菌(Fusartum graminearum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的菌丝生长均有抑制作用。显微观察苹果炭疽病菌丝经纯化蛋白处理后,正常的菌丝形状比较规则,细长,而经蛋白处理后的菌丝形状发生断裂、扭曲、畸形、肿大。7.热稳定结果表明,抑菌蛋白在20~60℃处理30min的情况下,其活性没有明显的变化,80℃处理30min虽然有所下降,但仍具有抑菌作用,说明该蛋白具有一定的耐热性;抑菌蛋白在pH4~7抑菌活性保持稳定,当pH高于7时,抑菌活性有所下降;紫外照射和经抑制剂、有机溶剂处理对抑菌蛋白的抑菌活性均没有影响。上述结果表明,该抑菌蛋白具有较好的稳定性。8.对蛋白6号条带做质谱解析,由Mascot数据分析软件检测NCBI数据库中细菌全库,通过计算得出分值在65分以上的结果可信(P<0.05)。质谱鉴定该条带含有两种蛋白,分别为假定蛋白BSU35980 Bacillus subtilis subsp.subtilis gi|16080651的匹配率为68%,相对分子量11079 Da,等电点4.78;丝氨酸羟甲基转移酶Bacillus subtilis subsp.subtilis gi|16080743的匹配率为67%,相对分子量为45575 Da,等电点为5.56。