西尼罗病毒(WestNilevirus,WNV)属于黄病毒科黄病毒属,是一种由蚊媒传播的重要人畜共患病病原,其终末宿主为人和马。目前,我国还没有该病毒的报道,但是,我国存在传播该病毒的媒介和中间宿主；另外,候鸟的迁徙、全球气候的变暖以及国际间人员和货物交流的日益频繁,该病毒随时都有可能在我国出现或者流行。但是,目前世界上仍然缺少有效的人用疫苗和药物来预防和治疗西尼罗病毒的感染。因此,开展西尼罗病毒的致病机理、药物筛选和疫苗的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。　　 本研究在完成西尼罗病毒非结构蛋白NS2B功能研究的基础上,开展了抗西尼罗病毒的药物筛选及抗病毒机理的研究。　　 1.西尼罗病毒非结构蛋白NS2B的功能研究　　 西尼罗病毒编码的NS3是一个多功能蛋白,在病毒的复制和组装中发挥十分重要的作用。在目前的抗病毒药物筛选过程中,常以NS3蛋白酶为靶标。作为一种重要的辅助蛋白,NS2B对于保持NS3的活性是必须的。因此,研究NS2B的功能对于了解其在病毒的复制和成熟过程中的作用及抗病毒药物的研发具有一定的意义。本研究通过比对黄病毒科病毒(西尼罗病毒、Kunjin病毒、乙型脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Zika病毒、登革病毒1-4型、黄热病毒、蜱传脑炎病毒、跳跃病病毒和Langat病毒)的NS2B氨基酸序列,发现D80DD和G83在这些病毒中具有很好的保守性。采用定点突变的方法获得在D80DD和G83位点突变的NS2B-NS3蛋白(D80DD/E80EE,D80DD/K80KK,D80DD/A80AA,G83/F,G83/S,G83/D,G83/K和G83/A),体外活性分析表明,所有突变的NS2B-NS3均无活性；采用含有报告基因的WNVRluc2A-Rep分析了D80DD和G83位点对WNV复制子的影响,表明D80DD和G83的突变影响了病毒RNA的复制,而不影响病毒蛋白的翻译。实验结果证明NS2B中的D80DD和G83可能参与到NS2B与NS3的相互作用的过程中,对于维持NS3的正确构象具有关键作用。同时也提示我们,以NS2B为靶点进行抗西尼罗病毒的药物筛选也是一种思路。　　 2.抗西尼罗病毒的药物筛选　　 为了寻找能有效抑制西尼罗病毒的小分子化合物,建立了基于NS2B-NS3为靶标的药物筛选平台。反应的缓冲液为10mMTris-HCl(pH8.0),20％(v/v)甘油；反应体系为100μl,蛋白酶和底物(pERTKR-AMC)的终浓度分别为5μg/ml和50μM；aprotinin(蛋白酶非特异性抑制剂)作为反应的阳性对照,终浓度为1μM;DMSO的终浓度为1％。　　 以该平台为基础,对微生物代谢产物、中草药水提取液和小分子化合物共计2704份进行筛选,其中有157份微生物代谢产物对蛋白酶活性的抑制率大于70％；2份中药的水提取液对蛋白酶的抑制率大于70％；2个小分子化合物对NS2B-NS3的抑制率大于70％。　　 在此基础上,开展了黄连水提取液及其主要成分对蛋白酶的抑制作用、细胞毒性作用以及对西尼罗病毒和其它病毒(黄病毒科病毒和非黄病毒科病毒)的抑制作用的分析。结果表明,来源于黄连的巴马丁对NS2B-NS3具有较强的抑制作用(可逆的非竞争性抑制,IC50=96μM),病毒抑制实验表明,巴马丁可以抑制西尼罗病毒的增殖(CC50=1031μM,EC50=3.6μM)。同时,巴马丁也能抑制登革病毒2型和黄热病毒,EC50分别为26.4和7.3μM,而对水泡性口炎病毒没有抑制作用,表明巴马丁是一种特异的黄病毒科病毒的抑制剂,具有潜在的抗病毒价值。　　 综上所述,本研究发现了NS2B的D80DD和G83对NS3的活性具有决定性作用,对病毒RNA的复制也有严重影响,却不影响病毒蛋白的翻译。提示我们,NS2B可以作为靶标开展抗西尼罗病毒的药物筛选工作；另外,以NS2B-NS3为靶标建立了抗西尼罗病毒的药物筛选平台,并且发现巴马丁对西尼罗病毒具有较好的抑制作用。由于巴马丁在临床上用于治疗妇科炎症等疾病,因此,其具有一定的开发价值。