论文部分内容阅读
脑梗死又称缺血性脑卒中,是一种严重危害世界人民健康的重大慢性非传染性疾病,也是世界上第二大死亡原因,给患者及社会造成了沉重的经济负担。脑梗死的危险因素很多,包括年龄、糖尿病、高血压、高脂血症、高同型半胱氨酸血症、心房颤动、卵圆孔未闭等。脑梗死发生后,分为中心的梗死区和周边的缺血半暗带区,若缺血半暗带区发生过度的炎症反应可以发生脑梗死加重的级联反应,如炎症刺激可以促使脑细胞发生程序性细胞死亡-细胞焦亡。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的炎症形式,目前研究发现细胞焦亡广泛参与多种疾病,如感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展,并发挥其重要作用。为此对细胞焦亡的深入研究有助于认识焦亡在相关疾病发生发展和转归中的作用,可能为疾病的临床治疗提供新思路。利拉鲁肽（Liraglutide）是一种新型长效胰高血糖素样肽-1类似物（glucagon-like peptide 1,GLP-1）,被批准用于2型糖尿病的药物治疗。利拉鲁肽可通过血-脑脊液屏障（blood-brain barrier,BBB）与分布在中枢神经系统的GLP-1受体结合。以往研究发现利拉鲁肽具过抗炎、抗氧化、影响自噬、促进血管新生、促进神经细胞可塑性等药理作用,利拉鲁肽通过不同的作用的机制在动物实验中对帕金森病、痴呆起到了较好的保护作用。在前期研究中我们实验室发现延迟给予利拉鲁肽干预的脑梗死动物模型可通过促进血管再生起到脑保护作用。2019年研究学者发现利拉鲁肽通过抑制细胞焦亡对非酒精性肝硬化动物起到了肝细胞的保护作用,然而,利拉鲁肽是否可通过抑制细胞焦亡发挥脑保护作用的研究鲜见报道。因此在本研究中,首先对我科收治的脑梗死急性期患者进行了回顾性分析,探讨脑梗死急性期与炎症指标超敏C反应蛋白的关系;后通过利拉鲁肽干预远端大脑中动脉闭塞（distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO）的动物模型及体外培养小胶质细胞构建氧糖剥夺模型进一步探讨利拉鲁肽的治疗是否通过抑制细胞焦亡的经典通路NLRP3/Caspase-1/IL-1β促进神经功能改善,减轻脑缺血损伤。实验研究分为以下四部分,各部分内容概述如下。第一部分血清hs-CRP水平与脑梗死急性期危险相关性研究目的:探讨hs-CRP水平与脑梗死急性期危险性的相关性。方法:回顾性分析102例脑梗死急性期患者和101例短暂性脑缺血发作患者的临床信息,分析两组患者hs-CRP、白细胞及中性粒细胞计数差异;分析hs-CRP水平与脑梗死急性期NIHSS评分相关性;对脑梗死急性期的亚组分析,评估hs-CRP水平在大动脉狭窄型与非大动脉狭窄型患者的NIHSS评分的相关性。数据分析采用SPSS25.0进行统计。结果:1.脑梗死急性期患者和短暂性脑缺血发作患者的一般资料比较结果显示:脑梗死急性期患者和短暂性脑缺血发作患者在性别、高血压、糖尿病、冠心病比较中无差别,无统计学意义（P＞0.05）;而脑梗死急性期患者的发病年龄(（60.71±9.82）大于短暂性脑缺血发作的发病年龄(（56.57±11.29）（P＜0.05）,具有统计学意义。2.脑梗死急性期患者与短暂性脑缺血发作患者hs-CRP、白细胞及中性粒细胞水平结果显示:102例脑梗死急性期患者和hs-CRP水平为4.42±7.12,101例短暂性脑缺血发作患者的hs-CRP水平为2.43±4.56,两者具有明显的统计学意义（P＜0.05）;两组白细胞及中性粒细胞比较无明显的统计学意义（P＞0.05）。3.脑梗死急性期患者超敏hs-CRP水平与NIHSS相关性研究结果显示:脑梗死急性期患者hs-CRP水平与患者NIHSS评分成正相关,亚组分析结果显示与非大血管狭窄型患者相比大血管狭窄型hs-CRP水平与NIHSS评分具有较高的相关性,R=0.71 P=0.00。小结:脑梗死急性期患者存在非感染性炎症反应,hs-CRP水平与脑梗死严重程度相关,且大血管狭窄型脑梗死患者中hs-CRP水平与NIHSS评分相关性更明显。第二部分利拉鲁肽对局灶性脑梗死小鼠神经功能改善的作用目的:通过对利拉鲁肽干预后的局灶性脑梗死小鼠进行神经功能相关测定,评价利拉鲁肽是否具有促进局灶性脑梗死小鼠神经功能改善的作用。方法:以雄性C57BL/6小鼠为研究对象建立d MCAO模型。雄性C57BL/6小鼠随机分为以下两组:d MCAO组:动物只接受d MCAO;d MCAO+利拉鲁肽治疗组:术前3天、术后即刻、术后连续3天,腹腔注射利拉鲁肽（246.7μg/kg/天）。两组术后第1、2、3天对各组进行Rota-Rod试验、m NSS神经功能评分、体重和血糖测量;两实验组在第3、7天通过TTC染色测定脑梗死体积;两组在术后第1、2、3天进行步态分析;术前和术后1、2、3天两实验组通过激光散斑成像仪监测脑血流量（CBF）。结果:1.血糖及体重结果显示:d MCAO组与d MCAO+Lg组在术前及术后1天、2天及3天均都无统计学意义（P＞0.05）。2.TTC实验结果显示:术后第3天,与d MCAO组相比Lg组小鼠的脑梗死体积明显减小（P＜0.01）,且术后第7天Lg组小鼠的脑梗死体积仍较d MCAO组体积减少（P＜0.05）。3.Rota-Rod实验结果显示:术前d MCAO组与d MCAO+Lg组无显著差异,但术后1天、2天及3天d MCAO组与d MCAO+Lg组具有明显的神经功能改善（P＜0.05）。4.mNSS实验结果显示:术后3天d MCAO组与d MCAO+Lg组小鼠相比,d MCAO+Lg组小鼠神经缺陷评分明显降低（P＜0.05）。5.小鼠步态功能分析实验结果显示:（1）即时奔跑速度:与Sham组小鼠相比,d MCAO+Lg组的奔跑速度于术后第1天、第2天及第3天具有明显的提高,第3天尤为显著（P＜0.01）。（2）左前肢步幅:与d MCAO组小鼠相比,d MCAO+Lg组的左前肢步幅于术后第1天、2天及3天均明显的增加（P＜0.05）。（3）左前肢足印面积:与d MCAO组小鼠相比,Lg组的左前肢足印面积于术后第2天及3天明显增加（P＜0.05）。（4）左前肢与身体中轴角度:与d MCAO组小鼠相比,d MCAO+Lg组的左前肢与身体中轴角度于术后第1天、2天及3天明显增加,尤其第3（P＜0.01）天更为显著,间接显示患者步态较前平稳。6.脑血流量测定结果显示:d MCAO组和d MCAO+Lg组小鼠病灶侧大脑半球于术后第3天显示出更高的脑灌注量（P＜0.05）。而术前、术后1天及2天两组小鼠脑灌注量未观察到明显差异。小结:利拉鲁肽明显缩小了局灶性脑梗死小鼠的梗死体积,并改善了脑梗死小鼠的神经功能,提示利拉鲁肽具有脑保护作用。第三部分利拉鲁肽对局灶性脑梗死小鼠细胞焦亡的影响目的:通过对利拉鲁肽干预后的局灶性脑梗死小鼠进行焦亡相关因子的测定来评估利拉鲁肽在脑梗死的动物模型中是否抑制了细胞焦亡。方法:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠为研究对象,雄性C57BL/6小鼠随机分为以下组:Sham组,d MCAO组,d MCAO+Lg组。术前3天、术后即刻、术后连续3天,腹腔注射利拉鲁肽（246.7μg/kg/天）。于术后第1天取材后进行RT-PCR、Western blot及免疫荧光技术行焦亡相关因子的检测;结果:1.采用RT-PCR技术发现与Sham组相比,d MCAO组中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及Gsdmd m RNA水平明显上调,给予利拉鲁肽注射液后NLRP3、Caspase-1、IL-1β及Gsdmd m RNA水平显著下调,其中NLRP3、IL-1βm RNA水平下降更显著,然而ASC m RNA水平的上调及下调水平均不显著,无统计学意义。2.采用Western blot技术发现与Sham组相比,d MCAO组中NLRP3、Pro-caspase1、Cleaved-caspase1、Pro IL-1β、Cleaved IL-1β及Gsdmd蛋白水平明显上调;与d MCAO组相比,d MCAO+Lg处理组NLRP3、Pro-caspase1、Cleaved-caspase1、Pro IL-1β、Cleaved IL-1β及Gsdmd蛋白水平显著下调;各组ASC的蛋白水平变化不明显。3.免疫荧光染色显示:与Sham组相比,d MCAO组中梗死周边NLPR3、Caspase1、IL-1β数量明显增高,给予利拉鲁肽处理后,NLPR3、Caspase1、IL-1β数量显著下降。小结:利拉鲁肽在局灶性脑梗死小鼠模型中显著下调焦亡相关因子的表达,提示利拉鲁肽对脑梗死后的细胞焦亡起到抑制作用。第四部分利拉鲁肽抑制细胞焦亡的机制研究目的:在体外运用小胶质细胞,构建氧糖剥夺模型,评价NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路相关分子的变化水平,从而评估利拉鲁肽是否通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路而进行脑保护作用。方法:采用小胶质细胞（BV2）为研究对象,建立OGD模型。实验一:将BV2细胞给予OGD处理并预实验按利拉鲁肽不同浓度分为以下组:Lg 1 n M组、10 n M组、100 n M组、200 n M组、1000 n M组。用CCK-8检测细胞活力及测定OGD最佳时间来进行下一步实验研究。实验二:将BV2细胞分为以下组:Sham组;OGD组:细胞接受OGD 6h;OGD+Lg组:细胞接受OGD 6 h,并给予200n M Lg;通过Western Blot测量Lg对焦亡相关因子的影响及用Elisa检测IL-1β,IL-18分泌功能。实验三:将BV2细胞分为以下组:Control组;OGD组:细胞接受OGD 6 h;OGD+Lg组:细胞接受OGD 6 h,并给予200n M Lg;OGD+Mcc950组:细胞接受OGD 6 h,并给予10n M Mcc950;通过Western Blot测量,评价利拉鲁肽是否通过NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路发挥抗焦亡作用。结果:1.利拉鲁肽（1 n M、10 n M、100 n M、200 n M、1000 n M）对OGD处理的BV2细胞有保护作用。我们选择利拉鲁肽200 n M剂量用于后续的体外实验。2.小胶质细胞置于OGD中不同时间（0-12 h）,应用CCK-8法检测细胞活力发现OGD处理6 h可导致约50%的细胞死亡,因此选定OGD6小时作为后续实验研究时间。3.酶联免疫吸附测定检测了OGD处理的BV2细胞IL-1β和IL-18的分泌情况。结果显示:与Sham组相比,OGD处理的BV2细胞使IL-1β和IL-18明显上升,两组之间具有明显的统计学意义（P＜0.0001）;加用Lg后,与OGD组相比,Lg明显抑制了IL-1β和IL-18分泌,两组之间具有明显的统计学意义（P＜0.01）。4.采用Western blot技术发现暴露于OGD的小胶质细胞NLRP3、Pro IL-1β、Cleaved IL-1β、Pro Caspase-1和Cleaved Caspase-1蛋白表达显著上调（P＜0.0001）;加用NLRP3特异性抑制剂Mcc950后NLRP3、Pro IL-1β、Cleaved IL-1β、Pro Caspase-1和Cleaved Caspase-1（p10）蛋白水平较OGD组下降（P＜0.05）;加用Lg处理后NLRP3、Pro IL-1β、Cleaved IL-1β、Pro Caspase-1和Cleaved Caspase-1蛋白水平下降尤为显著（P＜0.0001;）小结:利拉鲁肽可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β途径发挥抗焦亡作用,且NLRP3可能是利拉鲁肽在抗焦亡作用中的关键靶点。结论:1.脑梗死急性期患者存在非感染性炎症反应,炎症水平的高低可能与脑梗死严重程度呈相关性。2.利拉鲁肽在脑梗死动物模型中促进了小鼠的神经功能恢复,减少了脑梗死体积,具有脑保护作用。3.在体内实验和体外实验中,利拉鲁肽对脑梗死后的细胞焦亡相关因子起到抑制作用。4.利拉鲁肽抗焦亡机制可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β途径发挥作用,且NLRP3可能是利拉鲁肽在抗焦亡作用中的关键靶点。