【摘 要】
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研究背景:外泌体是一种细胞分泌的纳米级别的膜性囊泡,直径大小为30-200nm,含有生物大分子如蛋白质、脂质、核酸。外泌体在免疫调节、生殖发育、神经元通讯、控制衰老、细胞增殖过程中发挥着巨大的作用。血浆作为临床研究中最容易获得的生物样本,其外泌体的蛋白组学、转录组学等的变化能反映机体生理病理的情况,但其提取方法尚未有统一标准。研究目的:本研究通过对不同提取方法学（超速离心法、过滤加超速离心法、膜亲
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研究背景:外泌体是一种细胞分泌的纳米级别的膜性囊泡,直径大小为30-200nm,含有生物大分子如蛋白质、脂质、核酸。外泌体在免疫调节、生殖发育、神经元通讯、控制衰老、细胞增殖过程中发挥着巨大的作用。血浆作为临床研究中最容易获得的生物样本,其外泌体的蛋白组学、转录组学等的变化能反映机体生理病理的情况,但其提取方法尚未有统一标准。研究目的:本研究通过对不同提取方法学（超速离心法、过滤加超速离心法、膜亲和法、沉淀法）提取外血浆泌体的效率进行评价,为以后开展血浆外泌体研究提供一定的方法学选择依据。研究方法:本研究分别采用超速离心法、过滤加超速离心法、膜亲和法和沉淀法提取血浆外泌体,通过透射电子显微镜、BCA蛋白定量、Western Blot和颗粒粒度分析仪（NTA）及安捷伦生物分析仪分析不同方法提取外泌体的形态结构、外泌体蛋白表达差异、外泌体颗粒差异以及RNA表达差异,同时比较不同方法提取的外泌体纯度等特性,综合评价四种外泌体提取方法的效能。研究结果:透射电子显微镜观察显示4种方法均可提取到杯状托盘膜结构的外泌体形状的外泌体;NTA结果显示沉淀法提取的外泌体的粒子数最多结果为（6.2±2.47）×1011/mL血浆,过滤加超速离心法提取的外泌体的粒子数最少结果为（1.6±0.57）×109/mL血浆,4种方法提取的外泌体的直径分布无差异;BCA结果显示:沉淀法提取的蛋白水平最高结果为5610.0±72.4μg/mL血浆,过滤加超速离心法提取的外泌体蛋白含量最低结果为235.5±18.8μg/mL血浆,超速离心法和膜亲和法提取的外泌体的蛋白含量无差异结果分别为440.2±16.6μg/mL血浆和235.5±18.8μg/mL血浆;Western Blot结果显示:4种方法四种方法提取的外泌体均表达特异性蛋白Galectin-3BP和Tsg101以及CD9。所有外泌体均不表达细胞Marker Calnexin,膜亲和方法和沉淀法提取的外泌体含有大量的白蛋白Albumin,说明血浆蛋白污染程度较离心法高;RNA定量结果显示沉淀法提取的RNA水平最高（3.26±0.59ng/mL血浆）,超速离心法、过滤加超速离心法和膜亲和法的RNA水平无差异。此外,我们分别采用粒子浓度与蛋白比值和蛋白与RNA比值评价4种方法学提取外泌体的纯度,有趣的是,以粒子浓度与蛋白比值评价外泌体纯度,膜亲和法纯度最高,但以蛋白与RNA的比值评价外泌体纯度,沉淀法的纯度最低。进一步我们分析了 4种方法提取的外泌体的miR-130表达,沉淀法提取的外泌体的miR-130的CT值低（23.61±0.6）。研究结论:（1）不同方法学均可以具有典型特征的外泌体,但其颗粒浓度、蛋白含量和RNA水平不同;（2）沉淀法可获得较高的颗粒浓度和蛋白含量;（3）和超速离心法相比,过滤后再进行超速离心不仅降低了外泌体颗粒的浓度还降低了外泌体的蛋白浓度;（4）膜亲和法的白蛋白污染高于其他三种方法;（5）不同评价外泌体纯度方法的方法可能导致不同的结果。外泌体的分离技术是外泌体研究和应用的核心环节,在实际应用中,研究者需要根据相应的目的与要求,选择合适的分离纯化方法。
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