【摘 要】
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目的:研究热休克蛋白27(Heat shock proteins 27,HSP27)调控食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)恶性表型的机制;探索HSP27在食管鳞状细胞癌中对丙酮酸激酶M2亚型(Pyruvate Kinase Isotype M2,PKM2)的调控作用;揭示HSP27在食管鳞状细胞癌侵袭、增殖和迁移中的功能。方法:(1)在
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目的:研究热休克蛋白27(Heat shock proteins 27,HSP27)调控食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)恶性表型的机制;探索HSP27在食管鳞状细胞癌中对丙酮酸激酶M2亚型(Pyruvate Kinase Isotype M2,PKM2)的调控作用;揭示HSP27在食管鳞状细胞癌侵袭、增殖和迁移中的功能。方法:(1)在临床表型层面,使用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)技术检测HSP27在食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中的表达分布情况,经统计学分析HSP27与临床病理参数(患者年龄、肿瘤大小、性别、淋巴结转移和病理分型等)以及预后的相关性,以及与PKM2的关系。(2)在细胞功能层面,运用Western blot检测HSP27在食管癌细胞系中的本底表达。利用慢病毒转染方法将干扰HSP27表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)转染到HSP27高表达的食管鳞癌细胞系KYSE450和KYSE150细胞中,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分选得到稳定转染并敲低HSP27的细胞株,Western blot验证敲低效果并检测HSP27不同表达水平时PKM2及其他相关生物标记物表达量的变化。免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验和免疫荧光实验方法用来探究蛋白分子间的相互作用关系。应用细胞划痕实验检测HSP27表达量改变对食管鳞癌细胞迁移能力的影响,Transwell实验验证HSP27表达水平的改变对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)验证食管鳞癌细胞增殖能力的变化。结果:(1)临床表型:HSP27在食管鳞状细胞癌组织中表达水平(85/100,85%)相对高于癌旁正常组织(19/80,23.8%),差异有统计学意义(P<0.05)。同时,HSP27的表达水平与食管鳞状细胞癌的T分期和病理分级相关(P<0.05)。在Kaplan-Meier生存分析中发现,与HSP27低表达的食管鳞状细胞癌患者相比较,HSP27高表达的患者呈现出生存时间较短的趋势(Log-rank检验,P<0.05),即HSP27高表达的食管鳞状细胞癌患者预后较差。(2)细胞功能:Western blot结果显示HSP27在KYSE450细胞中表达量最高,依次是KYSE150、KYSE30、EC9706、TE-1和Eca109细胞。在KYSE450和KYSE150细胞中成功敲低HSP27的表达量(P<0.05),并且PKM2和EMT相关蛋白Vimentin表达水平随之明显下降(P<0.05),EMT相关蛋白E-cadherin表达升高(P<0.05)。IP实验结果提示HSP27与PKM2无直接互作关系;经进一步探究发现HSP27可通过自身苏素化调控PKM2的表达,即:IP实验结果显示HSP27与SUMO2/3有直接互作关系,并且免疫荧光结果显示HSP27和SUMO2/3共同定位于细胞质,且在形态学上相互融合。此外,敲低SUMO2/3后,HSP27、PKM2以及EMT相关蛋白Vimentin表达水平下降,EMT相关蛋白E-cadherin表达升高。本研究中与细胞功能相关的实验结果揭示:HSP27表达下调使食管鳞癌的细胞增殖能力(P<0.05)、侵袭能力以及细胞迁移能力(P<0.05)均受到抑制(P<0.05)。结论:HSP27通过结合SUMO2/3发生自身苏素化,稳定PKM2表达进而促进食管鳞状细胞癌的进程,提示HSP27有望成为食管鳞状细胞癌的治疗靶点。
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