背景：肿瘤、创伤、感染、先天性疾病、骨髓炎手术清创等导致的骨缺损以及软骨缺损是临床上的常见病,骨组织工程的实验研究为临床上的骨缺损及软骨缺损的治疗提供了新的思路,骨髓源性干细胞具有较强的自我更新能力及很好的可塑性,可以向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、少突树突细胞、肌细胞等细胞分化,但骨髓源性干细胞在人体的存在数量有限,取材时对患者造成的痛苦较大,成本也较高,一时间成为骨组织工程修复骨缺损及软骨缺损发展的瓶颈。2001年Zuk等人在人体的脂肪悬液中分离出了干细胞,这些脂肪源性干细胞和骨髓源性干细胞具有相似的生物学特性,同样可以向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、少突树突细胞、肌细胞等细胞分化,况且脂肪源性干细胞来源广泛、取材较容易、对患者造成的痛苦也较小,可以作为修复骨缺损、软骨缺损理想的种子细胞,成为近年来研究的热点。目的：1.分离兔脂肪源性干细胞。2.研究脂肪源性干细胞最佳的生长条件及生物学特性。3.经流式细胞仪检测脂肪源性干细胞CD29、CD34、CD44、CD45的阳性率。4.绘制脂肪源性干细胞的细胞生长曲线。5.研究兔脂肪源性干细胞在成骨诱导条件下的成骨诱导潜能,并用Gomori萘酚磷酸酯法染色及Von Kossa染色,检验成骨诱导结果。6.研究兔脂肪源性干细胞在成软骨诱导条件下的成软骨诱导潜能,并用阿利新兰染色及番红花-亮绿染色,检验成软骨诱导结果。7.筛选成软骨分化相关的miRNA,分析成软骨分化过程中相关的miRNA在脂肪源性干细胞成软骨分化过程中的表达模式。方法：1.脂肪源性干细胞的分离用水合氯醛对兔行腹腔注射麻醉,备皮、消毒、铺巾,无菌操作下沿腹部中线旁2cm处剪开约5cm大小切口,暴露其皮下白色脂肪组织,剪去表层筋膜及小血管,用PBS缓冲液洗涤,移入安瓿瓶,在超净工作台中用眼科剪剪碎成糊状,加入2倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶,置于37℃恒温培养箱消化60min,消化完成后加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化,200目筛网过滤,1000r/min离心10min,去上清,加入含10%FBS的DMEM/F12培养液,轻柔吹打均匀,接种于25C m2的培养瓶中,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中培养,每3d换液1次,每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长,待细胞融合约80%时去除培养液,加入适量0.25%胰蛋白酶消化,按1：2传代培养。2.脂肪源性干细胞流式细胞仪检测用胰酶消化法收集第5代脂肪间充质干细胞,调整密度为109/L,取CD29-PE, CD34-PE, CD44-PE, CD45-PE单克隆抗体各5ul,细胞悬液100μl,混匀后避光孵育15min,加PBS500μl重悬,流式细胞仪检测。3.绘制细胞生长曲线取第3、5、10、15代ADSCs,密度调整为1×107个/L,接种于96孔板,每孔200μl,各代4个复孔。每日取1板,每孔加入5g/L MTT20μ1,37℃孵育5h,加DMSO150μl,轻轻震荡10min,酶标仪490nm波长处测吸光度(A)值,连测9d,以细胞吸光度值(A)为纵坐标,时间(d)为横坐标,绘制生长曲线。4.脂肪源性干细胞成骨诱导分化当原代细胞传代至第3代并覆盖瓶底约80%时,消化瓶底细胞并收集,接种于6孔板中,3孔为实验组,剩余3孔为对照组,24h后更换为含DMEM/F12,10%FBS,0.1μmol/L地塞米松,50μg/ml抗坏血酸,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的成骨诱导液,对照组加入普通培养液,诱导2周后取细胞爬片进行Gomori萘酚磷酸酯法与Von Kossa染色,定期倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍摄记录。5.脂肪源性干细胞成软骨诱导分化当脂肪源性干细胞的原代细胞传至第3代并覆盖瓶底约80%时,消化瓶底细胞并收集,接种于6孔板中,3孔为实验组,剩余3孔为对照组,24h后更换为含DMEM/F12,0.1μmol/L地塞米松,50μg/ml维生素C,10ng/ml TGF-β1,6.25μg/ml胰岛素,6.25μg/ml转铁蛋白成软骨诱导液,对照组加入普通培养液,诱导2周后取细胞爬片行阿利新兰染色及番红花-亮绿染色,定期倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍摄记录。6.基因芯片筛选成软骨相关miRNA从兔腹部皮下脂肪组织中分离、培养脂肪源性干细胞。应用基因芯片技术筛选脂肪源性干细胞成软骨诱导前后表达差异显著的miRNA,采用RT-PCR技术检测差异显著的miRNA,在成软骨诱导第7天、第14天、第21天上调和下调相对表达强度,以ELISA试剂盒检测相应时间点成软骨相关蛋白的表达情况。结果：1.脂肪源性干细胞形态学观察6h后原代细胞大部分贴壁,呈圆形、短梭形或多角形,分布均匀,至36h大部分细胞成长梭形,细胞体积明显增大,胞质内有明显颗粒,72h后换液继续培养,至第7天达80%融合,用胰蛋白酶传代培养,24h后呈纤维样形态,漩涡状、辐射状或平行样排列,分布均匀,3～4d达80%融合。随传代次数增加,细胞形态无明显改变,传代细胞较原代细胞明显增大。2.脂肪源性干细胞流式细胞仪检测结果流式细胞仪检测结果显示不同代数细胞表型检测结果CD29、CD44均高表达,阳性率均在95%以上,且随代数增加而无明显下降趋势,CD34、CD45呈低表达,阳性率均低于5%。3.脂肪源性干细胞生长曲线结果显示第3、5、10、15代脂肪间充质干细胞的生长曲线无明显差异,均成“S”形,约4天进入对数生长期,约6天达峰值,随代数增加生长曲线无明显变化。4.脂肪源性干细胞成骨诱导分化鉴定取第2、4、6、8代细胞用成骨诱导液分化后分别用Gomori萘酚磷酸酯法染色(ALP染色)、VonKossa染色。随诱导时间延长,ALP染色表现为碱性磷酸酶阳性的细胞逐渐增多,多表现为棕褐色颗粒,Von Kossa法矿化结节染色见钙结节呈黑色,表现为VonKossa阳性,而加入普通培养基的对照组均为阴性表现。5.脂肪源性干细胞成软骨诱导分化鉴定取第2、4、6、8代细胞用成软骨诱导液分化后分别用阿利新兰染色及番红花-亮绿染色,随诱导时间延长,阿利新兰染色后诱导细胞成蓝色,呈阿利新兰染色阳性；番红花-亮绿染色后诱导细胞成红色,无绿色,呈番红花-亮绿染色阳性。6.成软骨诱导前后miRNA基因芯片筛选结果脂肪源性干细胞在传至第4代后可获得均一性较高的脂肪源性干细胞；基因芯片技术筛选出成软骨分化前后表达差异明显的10个miRNA,其中6个上调,4个下调；成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、X型胶原、Aggrecan的质量浓度在成软骨分化第7天明显升高,第14天达峰值,第21天略有下降。结论：脂肪源性干细胞流式细胞仪检测结果显示不同代数细胞表型检测结果CD29、CD44均高表达,阳性率均在90%以上,且随代数增加而无明显下降趋势,CD34、CD45呈低表达,阳性率均低于10%,其中CD29在血管发育过程中起关键作用,CD44在新生细胞外基质生成过程中起重要作用,这种检测结果和骨髓源性干细胞的检测结果一致,说明在细胞表面分子表达上脂肪源性干细胞和骨髓源性干细胞具有很相似的共性。绘制生长曲线,结果显示第3、5、10、15代脂肪源性干细胞的生长曲线无明显差异,均成“S”形,约4天进入对数生长期,约6天达峰值,随代数增加生长曲线无明显变化,说明脂肪源性干细胞的增值特点较稳定,可多次重复利用。6h后原代细胞大部分贴壁,呈圆形、短梭形或多角形,分布均匀,至36h大部分细胞成长梭形,细胞体积明显增大,胞质内有明显颗粒,72h后换液继续培养,至第7天达80%融合,用胰蛋白酶传代培养,24h后呈纤维样形态,漩涡状、辐射状或平行样排列,分布均匀,3～4d达80%融合。随传代次数增加,细胞形态无明显改变,传代细胞较原代细胞明显增大,多次培养的脂肪源性干细胞生物学特性较稳定,易于分离和培养,经液氮冷冻保存及复苏后,生物学特性无明显变化。本实验证明了脂肪源性干细胞在诱导条件下具有向成骨分化的潜能,传代后各项生物特性指标无明显下降,生物性能稳定,切取材方便、创伤小,可作为修复骨缺损的理想的种子细胞。脂肪源性干细胞在成软骨诱导条件下,分别用阿利新兰染色及番红花-亮绿染色,均呈阳性表达,有酸性粘多糖的分泌,而软骨细胞的主要功能就是分泌酸性粘多糖和胶原蛋白,本实验随时间的延长,染色结果有加重的趋势,分泌酸性粘多糖和胶原蛋白的含量有增加的趋势,证明了脂肪源性干细胞在成软骨诱导条件下具有成软骨分化的潜能,可以作为修复软骨缺损的理想种子细胞。