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传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitisvirus,ILTV）引起的急性、高度接触性传染病,死亡率高,呈地方性流行趋势。目前,市场上用于防控ILT的最主要疫苗仍然是基于改良的ILT弱毒活疫苗,但它普遍存在毒力返强或在混合感染过程中可作为发病诱因等问题,急需寻找一种新的疫苗用于防控ILT,其中构建鸡痘病毒（Fowlpoxvirus,FPV）活载体疫苗是一个理想的替代选择。基于此,本实验室前期研究构建了表达ILTV优势流行株gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV-ILTVgB）,并初步测定了其对SPF（Specific pathogen free,SPF）鸡的免疫效力,结果显示,gB基因的供体毒株攻击后,该疫苗对SPF鸡的保护率为100%,高于商品化疫苗（cr-FPV）组,免疫效果良好,可作为疫苗候选株开发使用。因此,本研究以rFPV-ILT VgB为研究对象,对其进行了较为系统的免疫效力及生物安全性评价,为该疫苗的市场化应用奠定基础。1.rFPV-ILTVgB的理化特性及遗传稳定性研究将rFPV-ILTVgB与wt-FPV282E4分别经不同理化条件处理后,接种到鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblastcell,CEF）中,通过测定细胞半数感染量（Tissue culture infectious dose 50,TCID50）的变化探究gB基因的插入是否会影响FPV的理化特性;将rFPV在CEF上连续培养30代,进行序列测定,并应用间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescentassay,IFA）鉴定gB蛋白的表达,评价rFPV在体外的遗传稳定性;将rFPV在SPF鸡体中进行连续传代,评价rFPV在体内的传代致病性。结果表明,rFPV-ILTVgB和wt-FPV282E4均对高温、胰酶和氯仿敏感,在pH 3.0～9.0的范围内或经24 h的乙醚作用,病毒滴度变化不明显;rFPV-ILTVgB经CEF连续传代后,gB基因序列未发生任何突变,gB蛋白表达稳定;经SPF鸡连续传代后,gB基因的阳性检出率逐渐降低,表明rFPV难以在鸡体内连续传代,不存在毒力返强的风险。2.rFPV-ILTVgB对SPF鸡的免疫效力试验将21日龄SPF鸡随机分为4组,于翅部无血管区刺种免疫rFPV-ILTVgB,并设置cr-FPV、wt-FPV282E4和PBS组作为对照,每组免疫后7、14、21 d采血分离血清,利用ELISA方法检测针对FPV和ILTV的抗体水平;免疫后7、14、21 d分别处死3只鸡,采集脾脏样本,利用qRT-PCR检测IL-2、IL-6、IL-18和IFN-γ的相对表达水平。免疫后21 d,分别用FPV 1370株、102株及ILTVI19株、WG株进行攻毒,评价疫苗对SPF鸡的免疫效力,并采集ILTV攻毒后3、5、7 d的喉头拭子进行病毒分离,测定排毒情况。ELISA抗体检测结果显示,免疫后21 d,针对FPV的血清抗体达到高峰,平均可达0.86±0.11,免疫后21 d,针对ILTV的血清抗体达到较高水平,平均可达为0.77±0.09;免疫后7、14、21d,采集脾脏对代表性细胞因子检测发现,与PBS组相比,其余各组均可以显著诱导IL-2、IL-18、IFN-γ和IL-6的转录表达水平。用FPV 1370株和 102 株攻击时,rFPV-ILTVgB、cr-FPV、wt-FPV282E4 和 PBS 组对 SPF 鸡的保护指数分别为90、60、90、0和90、80、90、0;用ILTVI19株和WG株攻击时,rFPV-ILTVgB、cr-FPV、wt-FPV282E4 和 PBS 组对 SPF 鸡的保护指数分别为 70、60、20、0和100、100、16.7、0。ILTV的排毒检测结果显示所有试验组均可排毒,差异不显著（P>0.05）。3.rFPV-ILTVgB对靶动物及非靶动物的安全评价将21日龄SPF鸡随机分为5组,分别免疫rFPV-ILTVgB、10倍剂量rFPV-ILTVgB、cr-FPV、wt-FPV282E4和PBS。通过称重、血液理化指标检测、病毒体内分布、组织病理学观察、环境传播及同居感染能力的测定,系统评价rFPV对SPF鸡的安全性;通过ELISA方法监测免疫后分别针对FPV及ILTV的抗体,评价免疫后抗体的产生及持续时间。结果显示,rFPV-ILTVgB免疫后对SPF鸡血液的个别指标稍有影响,对增重无影响;组织病理学观察及体内分布结果显示,除接种部位皮肤有轻微病变外,其他器官均未发现任何病变,且未分离到病毒;同居感染结果显示,rFPV不会通过接触传播;饲料、饮水、粪便拭子中也均未分离到病毒,对周围环境安全;抗体监测结果显示,免疫后21～28 d针对FPV及ILTV的抗体均达到高峰,免疫后63 d仍能检测到一定水平的抗体。将48只麻鸭随机分成3组,分别免疫rFPV-ILTVgB、10倍剂量rFPV-ILTVgB和PBS。免疫后通过称重、血液理化指标检测及组织病理学观察,评价rFPV对麻鸭的安全性。结果表明,rFPV-ILTVgB免疫后对麻鸭血液的个别指标稍有影响;各组增重无差异,组织脏器均未发现任何可见病变。综上所述,rFPV-ILTVgB表达稳定,免疫效力良好,针对靶动物和非靶动物均是安全的,具有同时开发成防控鸡痘和鸡传染性喉气管炎疫苗的潜力。