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长期吸入生产性石英粉尘所致的职业病——矽肺病以肺组织持续性炎性反应及进行性纤维化为特征。矽肺病是我国高发职业病之一,因其发病机制尚不完全清楚,目前缺乏有效治疗手段。既往研究提示,吸入的石英粉尘首先被肺泡巨噬细胞吞噬,引起多种细胞浸润以及促炎细胞因子的释放从而扩大炎性反应,然而石英粉尘致巨噬细胞死亡及炎性反应的机制仍不清楚。本课题组前期研究发现,生长停滞特异性蛋白6（Growth arrest specific protein 6,Gas6）参与调节石英粉尘导致的小鼠肺部炎性反应,并引起巨噬细胞活力下调,结合近期研究报告的巨噬细胞自噬在石英粉尘诱导的肺部炎症和胶原沉积的关键作用。我们提出设想:Gas6是否通过自噬参与调控石英粉尘诱导的炎性反应?本研究首先通过动物实验观察Gas6对染石英尘小鼠肺部自噬的定位及影响,然后通过巨噬细胞染尘分析Gas6调控自噬对炎性反应的作用。研究分以下两个部分。第一部分Gas6在石英粉尘致小鼠肺部自噬中的作用目的:通过对野生型（Wild Type,WT）小鼠和Gas6基因敲除(Gas6-/-)小鼠进行石英染尘,在不同时间点观察小鼠肺部自噬水平,以探究Gas6对石英所致小鼠肺部自噬的影响。方法:采用单次气管内滴注石英粉尘悬液建立小鼠染尘模型。将48只雄性WT C57BL/6小鼠和48只相同种属Gas6-/-小鼠按照体重随机分4组为:WT生理盐水组,WT石英组,Gas6-/-生理盐水组,Gas6-/-石英组,每组24只。生理盐水组小鼠滴注50μL生理盐水,石英组小鼠滴注50μL浓度为50 mg/m L的石英粉尘悬液。在染尘后第7 d、28 d、84 d每组分别取8只小鼠处死采样。通过免疫荧光法检测自噬蛋白LC3和巨噬细胞标志物F4/80水平,透射电子显微镜检测小鼠肺组织自噬体超微结构,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠肺泡灌洗液中Gas6水平,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测Gas6、自噬相关因子Atg5、Beclin1、P62和溶酶体标志物LAMP1的m RNA表达水平,免疫印迹法（WB）测定自噬相关因子LC3、p-m TOR、Atg5、Beclin1、P62和溶酶体关联膜蛋白1（LAMP1）的蛋白表达水平。结果:（1）在染尘后第7 d、28 d、84 d,WT小鼠肺部自噬体数量均增多,自噬蛋白LC3增加,自噬相关基因Atg5、Beclin1、P62 m RNA表达水平均有升高（P＜0.05）;WT染尘小鼠肺部溶酶体数量减少,溶酶体标志物LAMP1 m RNA表达水平降低（P＜0.05）。免疫荧光结果显示自噬蛋白LC3能和F4/80免疫共标,说明小鼠肺部自噬发生于肺巨噬细胞。同时,WT小鼠染尘后三个时间点肺泡灌洗液中Gas6蛋白水平以及肺组织Gas6 m RNA表达水平均升高（P＜0.01）。结果提示石英粉尘引起小鼠肺部Gas6水平升高和自噬增强,并损伤溶酶体。（2）与WT石英组相比,Gas6-/-石英组小鼠染尘后三个时间点肺巨噬细胞自噬体数量均明显降低,肺组织自噬相关蛋白LC3、P62水平也明显下降（P＜0.05）,Atg5蛋白在染尘第7天降低（P＜0.05）,其他两个时间点无明显差异,p-m TOR蛋白在三个时间点均明显升高（P＜0.05）;与WT石英组相比,Gas6-/-石英组小鼠染尘后三个时间点肺巨噬细胞溶酶体增多,溶酶体膜蛋白LAMP1水平也明显升高（P＜0.05）。结果提示Gas6基因敲除缓解石英粉尘引起的自噬体积累,同时溶酶体损伤得到一定程度缓解。结论:石英粉尘暴露可引起小鼠肺巨噬细胞自噬增加,并破坏溶酶体,导致自噬溶酶体降解受阻,共同促进自噬体的积累。而Gas6基因敲除可以明显抑制自噬,缓解自噬体的积累,促进自噬体的降解。第二部分Gas6调控自噬促进石英粉尘致巨噬细胞炎性反应目的:探究Gas6调控自噬对石英粉尘致巨噬细胞炎性反应的作用。方法:实验采用不同浓度（0、37.5、75、150、300μg/m L）呼吸性标准石英粉尘（粒径1μm）染毒RAW264.7巨噬细胞24 h,同时设定自噬促进组（Rapa+silica（300μg/m L,下同））、自噬抑制组（3-MA+silica）、Gas6基因沉默组（si RNA-Gas6+silica）、Gas6基因沉默+自噬促进组（si RNA-Gas6+silica+Rapa）、Gas6基因沉默+自噬抑制组（si RNA-Gas6+silica+3-MA）。通过CCK8法检测细胞活力,乳酸脱氢酶试剂盒测定LDH活力,ELISA试验检测细胞上清液中Gas6和炎性因子IL-6、TNF-α表达水平,免疫荧光法测定细胞自噬因子LC3和P62水平,q RT-PCR方法检测自噬相关因子LC3、Beclin1、P62的m RNA表达水平,WB测定Gas6和自噬相关因子LC3、Beclin1、P62的蛋白表达水平。结果:1.石英粉尘诱导巨噬细胞自噬增强随着石英粉尘浓度的增加,染尘巨噬细胞活力降低,LDH活力增加,提示细胞受损。染尘组自噬相关因子LC3、Beclin1、P62的m RNA及蛋白表达水平随染尘浓度的增加而增加（P＜0.05）。免疫荧光检测结果显示,染尘组巨噬细胞LC3和P62蛋白水平均有所增加（P＜0.05）,提示石英粉尘诱导巨噬细胞自噬增强。2.自噬参与石英粉尘致巨噬细胞炎性反应巨噬细胞染尘24 h后,炎性因子IL-6、TNF-α的表达水平呈现浓度依赖性升高（P＜0.05）。与单纯石英染尘组比较,自噬促进组（Rapa+silica）细胞活力下降（P＜0.01）,自噬相关因子Beclin1、P62 m RNA水平增加（P＜0.05）,上清液中IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.01）。与单纯石英染尘组比较,自噬抑制组（3-MA+silica）细胞活力升高,Beclin1、P62 m RNA水平下降（P＜0.01）,上清液中IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.01）。研究结果提示自噬激活可显著下调炎性反应,而自噬抑制可以进一步促进巨噬细胞内石英粉尘引起的炎性反应。3.Gas6基因沉默抑制石英粉尘引起的巨噬细胞自噬与对照组相比,石英组Gas6水平显著升高（P＜0.05）,Gas6基因沉默组（si RNA-Gas6+silica）Gas6表达下降（P＜0.01）。与单纯石英染尘组比较,Gas6基因沉默组LC3荧光强度以及自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达下降（P＜0.05）,提示沉默Gas6可抑制巨噬细胞自噬。4.Gas6基因沉默通过抑制自噬促进巨噬细胞分泌炎性因子与单纯石英组比较,Gas6基因沉默组巨噬细胞炎性因子IL-6、TNF-α水平显著升高（P＜0.05）。但自噬促进组Rapa处理可以逆转Gas6基因沉默的作用,与Gas6基因沉默组比较,Rapa处理减少巨噬细胞的IL-6、TNF-α的分泌（P＜0.05）,3-MA处理则可以进一步促进Gas6的此种作用,上清液IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）。提示Gas6可通过调控自噬影响巨噬细胞分泌炎性因子。结论:石英粉尘诱导的巨噬细胞炎性反应受Gas6和自噬影响。Gas6基因沉默可以通过抑制细胞自噬,加重石英粉尘诱导的巨噬细胞炎性因子分泌,从而促进炎性反应。